Обнаружен белок, блокирующий действие противоопухолевого препарата на глиобластому

Глиобластома — это агрессивная и высокоинтрузивная форма рака головного мозга, трудно поддающаяся лечению. При глиобластоме пациентам назначают комбинацию радио- и химиотерапии, и в качестве химиотерапевтического агента используют темозоломид (TMZ) — алкилирующий препарат. Несмотря на эффективность терапии на первых порах, клетки опухоли быстро привыкают к действию этого цитостатика. Авторы статьи, опубликованной в Advanced Science, проанализировали возможные причины этого и показали, что в адаптации раковых клеток к TMZ участвует белок из группы псевдокиназ — PANK4.

Одной из причин возникновения глиобластомы называют нарушения в передаче сигналов между протеинкиназами. Ученые провели скрининг более 700 протеинкиназ с использованием библиотеки малых интерферирующих РНК (siRNA). Они проводили нокдаун киназ в резистентных клетках глиобластомы U87MG, а затем обрабатывали их сублетальной дозой темозоломида. Затем авторы работы оценивали различия в клеточной пролиферации, чтобы выявить киназы, связанные с адаптацией клеток к препарату. Выяснилось, что наиболее перспективной мишенью для нокдауна служит PANK4 — эта псевдокиназа оказалась наиболее значимой для пролиферации клеток в присутствии препарата.

Далее ученые подавили экспрессию PANK4 в других резистентных линиях глиобластомы и обрабатывали их сублетальными дозами темозоломида. Это приводило к снижению клеточной пролиферации, и эффект усиливался при увеличении дозы препарата. При этом повторная экспрессия PANK4 приводила к полной резистентности клеток к TMZ. Также исследователи обнаружили, что клоногенный потенциал резистентных клеточных линий глиобластомы снизился после комбинированной терапии. Это дополнительно подтверждает, что истощение PANK4 усиливает цитотоксичность темозоломида.

При нокдауне PANK4 одновременно с обработкой TMZ пролиферация клеток снижалась, также эти условия индуцировали клеточную гибель. Чтобы изучить этот эффект, ученые измерили уровни апоптоза с помощью окрашивания аннексином V и 7-AAD (7-аминоактиномицином D). Они показали, что ни воздействие сублетальных концентраций TMZ, ни нокдаун PANK4 по отдельности не влияли на жизнеспособность клеток. Индукция апоптоза была выражена только в ответ на комбинацию нокдауна PANK4 с обработкой TMZ.

Чтобы подтвердить свои выводы in vivo, исследователи провели опыты на мышиной модели глиобластомы. Они показали, что как нокдаун PANK4 с помощью siRNA, так и TMZ по отдельности не оказывали значимого влияния на рост опухоли у животных. Однако комбинация нокдауна исследуемой псевдокиназы с лечением TMZ замедляла прогрессию рака. Кроме того, в отобранных образцах опухолевой ткани значимо снижалась пролиферация — это происходило только в случае одновременного нокдауна PANK4 и лечения TMZ.

Чтобы охарактеризовать роль PANK4 в формировании устойчивости к TMZ, авторы исследования воспользовались протеомным подходом. В клетках глиобластомы они идентифицировали 6756 пептидов, количество 1005 из них значимо менялось после нокдауна PANK4. Дальнейший анализ выявил ряд белков (GSTP1, NQO1, PRDX3, PRDX1, ADH5, SRXN1, DHFR, GSTM2, ESD, ALDH1A1, GSTM3, MTARC2, AKR1B10, PARK7), играющих центральную роль в защите клеток от различных типов вредных метаболитов, особенно активных форм кислорода (АФК). Анализ обогащения наборов генов (GSEA) показал, что при нокдауне PANK4 снижается клеточный ответ на окислительный стресс.

Чтобы дополнительно подтвердить участие PANK4 в клеточном ответе на окислительный стресс, ученые исследовали влияние модуляции PANK4 на внутриклеточные уровни АФК в резистентных клетках глиобластомы. Оказалось, что подавление PANK4 приводило к резкому повышению уровней АФК в модельных клетках. И наоборот, оверэкспрессия PANK4 уменьшала количество АФК в этих клетках, подтверждая вклад PANK4 в модулирование окислительного стресса. Авторы заключили, что PANK4 способствует детоксикации клеток и предотвращает, в частности, повреждения, вызванные окислительным стрессом.

Как упоминалось ранее, PANK4 — это псевдокиназа. Она содержит замены двух ключевых остатков в каталитическом домене (Glu138Val и Arg207Trp), которые необходимы для его киназной активности. Также в PANK4 имеется фосфатазный домен DUF89, который отвечает за контроль повреждений и удаление потенциально вредных скоплений метаболитов или побочных продуктов. Чтобы оценить, требуется ли фосфатазная активность PANK4 для воздействия на чувствительность к TMZ, исследователи оверэкспрессировали PANK4 дикого типа и две мутантных формы без фосфатазной активности в клетках резистентной глиобластомы. Оказалось, что мутантные формы не способствуют пролиферации клеток так, как это делает PANK4 дикого типа, в том числе в присутствии TMZ. Исходя из этого, ученые предположили, что фосфатазная активность PANK4 модулирует чувствительность клеток к препарату.

Исследование демонстрирует, что снижение экспрессии PANK4 препятствует развитию резистентности глиобластомы к темозоломиду. Это происходит за счет того, что в клетках нарушаются механизмы ответа на стресс, и их пролиферация в присутствии препарата снижается.

Экспрессионный шум делает нейробластому устойчивой к химиотерапии