Очень быстрый CRISPR-Cas9

Ученые разработали метод редактирования генома, основанный на системе CRISPR-Cas9, и назвали его vfCRISPR (very fast CRISPR), так как он способен создавать двухцепочечные разрывы за секунды.

Для того чтобы комплекс нуклеазы Cas9 с гидовой РНК нашел правильную последовательность ДНК, может потребоваться несколько часов. Из-за этого двухцепочечные разрывы случаются в клетке несинхронно, и невозможно добиться максимально эффективного запуска системы репарации. Чтобы лучше контролировать действие Cas9, исследователи создали гидовую РНК (gRNA) со светочувствительными нуклеотидами. Комплекс такой gRNA и Cas9 связывается со своей ДНК-мишенью, но не может ее расщепить до активации комплекса пучком света.

В статье, опубликованной в Science, исследователи продемонстрировали, что синхронизация нуклеазной активности при помощи света улучшает эффективность работы системы репарации: при тестировании на культуре клеток инсерции или делеции (поломки гена) возникали в 97% аллелей, подверженных воздействию системы. Действие vfCRISPR основано на нуклеазной активности фермента Cas9, полученного из Streptococcus pyogenes, и оптимизированной gRNA. Ученые заменили несколько урацилов в определенной области гидовой РНК на светочувствительные дезоксирибонуклеотиды, модифицированные 6-нитропиперонилоксиметилом. В итоге комплекс из нуклеазы Cas9 и модифицированной гидовой РНК сохраняет способность к узнаванию таргетной ДНК, так как комплементарная ей часть гидовой РНК остается нетронутой, однако теряет нуклеазную активность из-за стерических затруднений. При фотоактивации молекулы происходит диссоциация «лишних» групп, система приобретает нуклеазную активность и вносит двухцепочечный разрыв в течение нескольких секунд.

Кинетический анализ белков системы репарации показал, что клетки реагируют на появление двухцепочечных разрывов, внесенных vfCRISPR, в течение нескольких минут. Далее ученые визуализировали работу системы vfCRISPR непосредственно в живой клетке при помощи помеченного флуоресцентным белком Cas9 и пронаблюдали множественные циклы образования и распада очагов репарации при помощи меченого белка системы репарации 53BP1.