Очень быстрый CRISPR-Cas9

Ученые разработали метод редактирования генома, основанный на системе CRISPR-Cas9, и назвали его vfCRISPR (very fast CRISPR), так как он способен создавать двухцепочечные разрывы за секунды.

Для того чтобы комплекс нуклеазы Cas9 с гидовой РНК нашел правильную последовательность ДНК, может потребоваться несколько часов. Из-за этого двухцепочечные разрывы случаются в клетке несинхронно, и невозможно добиться максимально эффективного запуска системы репарации. Чтобы лучше контролировать действие Cas9, исследователи создали гидовую РНК (gRNA) со светочувствительными нуклеотидами. Комплекс такой gRNA и Cas9 связывается со своей ДНК-мишенью, но не может ее расщепить до активации комплекса пучком света.

В статье, опубликованной в Science, исследователи продемонстрировали, что синхронизация нуклеазной активности при помощи света улучшает эффективность работы системы репарации: при тестировании на культуре клеток инсерции или делеции (поломки гена) возникали в 97% аллелей, подверженных воздействию системы. Действие vfCRISPR основано на нуклеазной активности фермента Cas9, полученного из Streptococcus pyogenes, и оптимизированной gRNA. Ученые заменили несколько урацилов в определенной области гидовой РНК на светочувствительные дезоксирибонуклеотиды, модифицированные 6-нитропиперонилоксиметилом. В итоге комплекс из нуклеазы Cas9 и модифицированной гидовой РНК сохраняет способность к узнаванию таргетной ДНК, так как комплементарная ей часть гидовой РНК остается нетронутой, однако теряет нуклеазную активность из-за стерических затруднений. При фотоактивации молекулы происходит диссоциация «лишних» групп, система приобретает нуклеазную активность и вносит двухцепочечный разрыв в течение нескольких секунд.

Кинетический анализ белков системы репарации показал, что клетки реагируют на появление двухцепочечных разрывов, внесенных vfCRISPR, в течение нескольких минут. Далее ученые визуализировали работу системы vfCRISPR непосредственно в живой клетке при помощи помеченного флуоресцентным белком Cas9 и пронаблюдали множественные циклы образования и распада очагов репарации при помощи меченого белка системы репарации 53BP1.

Кроме того, авторы отмечают, что использование фотоактивируемой системы vfCRISPR потенциально может позволить повысить специфичность геномного редактирования за счет разделения процессов узнавания и расщепления таргетной ДНК и тем самым снизить офф-таргетную активность.