«Пончиковая» ПЦР для мультиплексной детекции ДНК

Ученые из США разработали портативный прибор для ПЦР-детекции ДНК и рассказали о нем в Nature Biomedical Engineering. Главный элемент прибора — тороидальная конвекционная камера, вмещающая микрочип с флуоресцентно «погашенными» олигонуклеотидными зондами.

Конвекционная ПЦР известна с 2002 года. Изначально ее проводили в капиллярных трубках, затем начали пробовать камеры других форм. Такая ПЦР не требует циклов нагревания и охлаждения. Вместо этого в камере создается температурный градиент, который вызывает конвекцию реакционной жидкости. Жидкость циркулирует между горячей и холодной областями камеры. При этом происходит амплификация ДНК-мишени: в горячей области двухцепоцечная ДНК расплетается, а в холодной — удваивается.

Новая тороидальная ПЦР-система представляет собой кольцевую реакционную камеру, в которую помещаются ДНК и компоненты ПЦР-смеси. После этого камера герметизируется и устанавливается вертикально между двумя нагревателями: на 95°C и на 60°C. В зоне 95°C жидкость становится менее плотной и поднимается, а попадая в зону 60°C, охлаждается и опускается. (В раннем варианте статьи, доступном на bioRxiv, авторы называют технологию Donut PCR — пончиковая ПЦР.)

На внутренней поверхности реакционной камеры размещен микрочип с пятнами, состоящими из флуоресцентого репортера и олигонуклеотидного зонда с гасителем. Когда ампликон связывается с зондом, гаситель перестает действовать, и пятно дает флуоресцентный сигнал. Микрочип обеспечивает мультиплексность анализа за счет пространственного разделения сигналов от разных мишеней.

Для детекции сигнала ученые использовали камеру эпифлуоресцентного микроскопа, установленного напротив тороидальной ПЦР-камеры. Амплификация происходит одновременно с гибридизацией, поэтому ход реакции можно отслеживать в реальном времени, что повышает точность количественного определения ДНК-мишени. Схема тороидальной ПЦР-системы и принцип ее работы представлены на иллюстрации.

Ученые удостоверились в том, что в конвекционной ПЦР-камере, в отличие от камер других форм, не образуется неспецифических продуктов амплификации. Кроме того, они оптимизировали скорость амплификации. Объем камеры приблизительно равен 25 мкл. По расчетам, один раунд циркуляции занимает 25 секунд. Стандартный протокол, предполагающий 40 циклов ПЦР, может быть завершен за 20 мин. Экспериментально полученные цифры были сопоставимы с расчетными. Возможность мультиплексной детекции подтвердили с помощью микрочипа на 48 пятен, содержащих зонды к человеческим, крысиным и мышиным генам.

На основе тороидальной ПЦР-системы ученые сконструировали прототип портативного инструмента, включающий пять модулей: механизм для размещения чипа между нагревателями; сама нагревательная система; светодиод и фильтр для освещения чипа и сокращения фоновой флуоресцентции; камера для получения флуоресцентных изображений и микроконтроллер для координации работы всех компонентов. Прибор может работать на батарейках. Прототип обошелся лаборатории в $2 500. Принципиальная схема изображена на рисунке.

Для валидации прибора ученые собрали микрочип из 15 зондов, нацеленных на ген 16S рРНК бактериальных патогенов. Прибор распознал отдельные виды бактерий как в монообразцах, так и в смесях из нескольких клинических изолятов. Кроме того, с помощью прибора авторы успешно детектировали 19 различных геномных локусов и 30 SNP в образцах человеческой ДНК. Результаты хорошо воспроизводились, от загрузки прибора до результата проходило около получаса, а нижний предел обнаружения составил 10 копий ДНК.

По мнению авторов, тороидальная ПЦР-система может найти применение в диагностике у постели больного.