Повреждение митохондриальной ДНК позволит диагностировать болезнь Паркинсона

Болезнь Паркинсона (БП) характеризуется прогрессирующей потерей дофаминергических нейронов в черной субстанции мозга, в результате чего возникает тремор, ригидность, брадикинезия и другие симптомы. К моменту постановки клинического диагноза множество нейронов уже теряется. Есть необходимость в ранней диагностике БП для нейропротективного вмешательства. Ведется поиск универсального биомаркеров крови. В новой работе международная группа ученых обнаружила кандидатный биомаркер, ассоциированный с повреждением митохондрий.

Давно известно, что нарушение работы митохондрий —компонент патогенеза БП. Митохондриальные токсины используются для моделировали БП in vitro и in vivo. Как идиопатическая, так и наследственная БП, включая ассоциированную с мутациями в гене LRRK2, связаны с повреждением митохондриальной ДНК (мтДНК). Патогенные мутации в LRRK2 — одна из самых часто встречающихся причин БП. Эти мутации происходят в каталитическом центре и усиливают киназную активность фермента, вызывая гиперфосфорилирование его субстратов. Часто встречается мутация G2019S. Однако даже у людей с этими мутациями клинические и неврологические проявления различаются. Нужны маркеры для стратификации пациентов, которые потенциально могут быть основаны на дисфункции митохондрий.

Ранее авторы обнаружили накопление повреждений мтДНК в мозге и периферических тканях пациентов с БП, ассоциированные с мутациями в LRRK2. В новой работе они проверили, можно ли использовать повреждение мтДНК в периферических тканях как биомаркер крови у людей с идиопатической или связанной с LRRK2-G2019S БП. Для этого они разработали новый тест Mito DNA_DX для оценки степени повреждения мтДНК.

Для Mito DNA_DX используется высокоточная ДНК-полимераза, флуоресцентный краситель и оптимизированные параметры ПЦР. Тест позволяет выявить повреждение ДНК в режиме реального времени. В ходе теста амплифицируется фрагмент, специфичный для митохондриального генома. Если повреждения мтДНК блокируют активность ДНК-полимеразы, то вырабатывается меньше ПЦР-продукта. Работу теста проверили на клетках HEK293 в среде с перекисью водорода, вызывающей повреждения ДНК.

Исследователи применили Mito DNA_DX для анализа лимфобластных клеток людей с идиопатической ПБ и здоровых контролей. У людей с БП был выше уровень повреждения мтДНК. То же было показано для носителей мутации LRRK2 G2019S. Количество митохондриальных геномов не различалось.

Лимфобластные клетки пациентов с БП обработали высокими концентрациями ингибитора LRRK2 — MLi-2. Это восстанавливало повреждения мтДНК до контрольных значений в течение 24 часов. Концентрации пониже тоже были действенными.

Далее опыты проводили на нейронах из вентрального отдела среднего мозга мышей с мутацией Lrrk2 G2019S в гомо- или гетерозиготе. Действительно, тест Mito DNA_DX выявил значительные повреждения мтДНК мутантных мышей по сравнению с контрольными мышами. Количество копий митохондриальных геномов не различалось.

Ранее уже было показано, что оверэкспрессия LRRK2 дикого типа не вызывает повреждений мтДНК в нейронах. Авторы проверили, какое действие окажет потеря LRRK2. Нокаут Lrrk2 у мышей нивелировал повреждения мтДНК.

Далее повреждения мтДНК оценили на замороженных мононуклеарных клетках периферической крови пациентов с идиопатической БП. Оно было повышено у пациентов по сравнению с контролями. Количество копий митохондриальных геномов не различалось.

Заморозка образцов может повлиять на оценку повреждения ДНК. Авторы подтвердили, что тест Mito DNA_DX чувствителен к такому повреждению. Чтобы исключить это влияние, исследователи привлекли дополнительную независимую когорту пациентов. Действительно, у пациентов мтДНК была повреждена сильнее. Повреждение мтДНК могло показать наличие болезни. Причем кровь собирали, когда пациенты принимали лекарства, а также когда не принимали, это не влияло на результат.

Интересно, что уровень повреждений мтДНК был повышен и у людей-носителей LRRK2-G2019S без симптомов БП. Значимых различий между носителями, у которых есть симптомы и у которых нет симптомов, не было. Повышение уровня повреждений мтДНК не было отмечено у пациентов с болезнью Альцгеймера. У здоровых контролей уровень повреждения мтДНК не менялся значительно со временем.

У исследования был ряд ограничений. Так, авторы не знают, изменяется ли уровень повреждения мтДНК с развитием болезни. Также необходимо дополнительно разработать и валидировать положительные и отрицательные контроли для теста Mito DNA_DX. Исследование необходимо повторить на более многочисленной когорте.

Тем не менее, авторы считают повреждение мтДНК многообещающим потенциальным биомаркером БП. «Простой тест крови позволит нам диагностировать заболевание раньше и раньше начать терапию. Также четкий диагноз позволит точно идентифицировать пациентов для участия в клинических исследованиях препаратов, что может привести к разработке лучшей терапии и потенциально даже метода излечения», — говорит Лори Сандерс, руководитель исследования и доцент в Медицинской школе университета Дьюка‎, кафедры неврологии и патологии.

Мутация, вызывающая болезнь Паркинсона, нарушает контакты между митохондриями и лизосомами