Предложена новая методика для создания искусственных хромосом человека

Искусственные хромосомы человека разработаны в качестве генетических векторов, несущих большие трансгенные конструкции или целые генные локусы (до миллиона п.н.). Они представляют собой редуцированные нативные хромосомы либо новосинтезированные генетические конструкции. Помимо сверхвысокой емкости, их важное преимущество — способность сохраняться при репликации в виде самостоятельных генетических элементов без интеграции в хромосомы клеток-хозяев. (Нецелевое встраивание трансгенов в хозяйский геном — типичная проблема вирусной доставки.) На сегодня разработано множество вариантов ИХЧ, и они продолжают совершенствоваться в разных лабораториях. ИХЧ получают с помощью двух подходов. Подход «сверху вниз» (top-down) — получение ИХЧ из нативных хромосом путем их максимальной редукции; при этом сохраняются компоненты, необходимые для стабильной репликации в клетке — центромерный и теломерные участки. Синтетический подход «снизу вверх» (bottom-up) позволяет получать линейные или кольцевые ИХЧ посредством синтеза и сборки больших прицентромерных участков ДНК in vitro. Широко используется синтетический способ получения ИХЧ на основе искусственных хромосом бактерий (ИХБ) и искусственных хромосом дрожжей (ИХД).

Одна из основных проблем при создании ИХЧ синтетическим способом — спонтанная мультимеризация («сшивание» между собой) ДНК-конструкций из которых формируются ИХЧ, а также неконтролируемые перестройки в этих конструкциях, иногда с участием фрагментов нативных хромосом. В результате генетический вектор может иметь огромные (за счет спонтанной мультимеризации) размеры и непредсказуемую структуру. Решением этой проблемы занялась команда исследователей из университета Пенсильвании (Филадельфия), Института Крейга Вентера и других научных центров. Результаты их работы опубликованы в Science.

Ученые предположили, что одной из причин неконтролируемой мультимеризации может быть недостаточная длина первичных фрагментов ДНК, включающих область центромер (100–300 т.п.н.), из которых формируются ИХЧ, например, при синтезе хромосом на основе ИХБ. Полноценную внутреннюю центромеру они содержат только в том случае, если мультимеризуются. Для проверки этого предположения ученые использовали более длинные (около 750 т.п.н.) фрагменты ДНК, а в качестве базовой — методику получения хромосом человека на основе ИХД.

На старте ученые использовали искусственную хромосому дрожжей (550 т.п.н.) с загруженной в нее бактериальной ДНК Mycoplasma mycoides, ДНК из 4-й человеческой хромосомы (локус 4q21, 182 т.п.н.), а также линкеры для рекомбинации и прочие «запчасти». Конструкцию, которую назвали YAC-Mm-4q21LacO, путем трансфекции на основе слияния сферопластов перенесли в лабораторные линии человеческих клеток фибросаркомы (НТ1080) и остеосаркомы (U2OS). В этих клетках происходило дальнейшее формирование ИХД, в результате образовывались однокопийные ИХЧ, которые были стабильны и устойчиво наследовались в ходе клеточных делений. Главным преимуществом ИХЧ на основе YAC-Mm-4q21LacO, как и ожидалось, оказалось отсутствие спонтанной мультимеризации.

По мнению ученых, результаты их работы найдут применение при создании ИХЧ, которые крайне востребованы во многих областях современной биологии и медицины. Так, ИХЧ используются для перепрограммирования клеток в ИПСК, создания трансгенных животных, разработки экспериментальных моделей лечения генетических заболеваний. Кроме того, с их помощью изучают функции хромосом и хромосомной нестабильности.

Предложен метод «переписывания» протяженных участков генома млекопитающих