Раскрыт механизм действия тековиримата на вирус оспы обезьян

Представители рода ортопоксвирусов вызывают у людей натуральную оспу и мпокс (оспу обезьян), возбудители — вирусы VARV и MPXV, соответственно. С 2022 года произошли две крупные эпидемии мпокс. Первая, вызванная штаммами клады II, быстро распространилась в мире; заболело в общей сложности более 90 тысяч человек, 179 умерло. Вторая вспышка, связанная с более вирулентными штаммами клады I, затронула главным образом Африку и уже привела к сотням смертей.

Цикл репликации ортопоксвирусов включает образование двух типов вирионов — зрелые и покрытые оболочкой. Первые реплицируются внутри клетки и состоят из капсида, окруженного одной мембраной. Для распространения в организме хозяина образуются оболочечные вирионы, покрытые тремя мембранами. Когда они покидают клетку, наружная оболочка сливается с плазматической мембраной, и наружу выходят вирусные частицы, покрытые двумя оболочками.

Для лечения оспы и мпокс используют два пероральных препарата: бринцидофовир (Тембекса) и тековиримат (TPOXX). Тековиримат широко применяется для лечения пациентов, зараженных штаммами MPXV клады IIb, но уже известно о нескольких устойчивых к нему вариантах. Этот препарат тормозит покрывание зрелого вируса оболочкой, и как показали исследования резистентных вариантов, он нацелен на оболочечный белок вируса — мембранную фосфолипазу F13. Но механизм этого взаимодействия был плохо изучен.

Международная команда ученых под руководством специалистов из Института Пастера в Париже получили структурную модель белка F13, связанного с тековириматом. Исследователи использовали кристаллографию, моделирование молекулярной динамики и целый комплекс биохимических методов. «Мы показали, что тековиримат действует как своего рода клей, который связывает две фосфолипазы F13 вместе, не давая им выполнять их роль в распространении вирусных частиц», — объяснил Пабло Гуардадо-Кальво, руководитель подразделения структурной биологии инфекционных болезней Института Пастера и последний автор статьи.

Фосфолипаза F13 прикрепляется к мембране с помощью двух модифицированных пальмитиновой кислотой цистеинов, расположенных в гидрофобной области взаимодействия с мембраной (membrane-interacting region, MIR). Для структурных исследований ученые создали растворимый вариант фосфолипазы (sF13) — удалили гидрофобный N-концевой фрагмент и внесли пять мутаций в MIR. Они получили две различные кристаллические формы sF13, но в обеих он был гомодимером, который поддерживался двумя спиралями и β-шпилькой. Регион контакта двух молекул образует сравнительно большую полость размером 290 Å. Гидрофобные N-концы и область взаимодействия с мембраной находятся на одной стороне димера, а два каталитических кармана — на другой и направлены наружу. Моделирование молекулярной динамики на мембранах, имитирующих состав мембраны комплекса Гольджи, показало, что F13 и на мембране может присутствовать в виде гомодимера. Участки молекулы F13, участвующих в образовании димера (интерфейсе димера) затрагиваются известными мутациями устойчивости к тековиримату.

Исследователи построили структурную модель взаимодействия sF13 и тековиримата и выяснили, что молекула препарата помещается в карман между двумя молекулами фосфолипазы, при этом стабилизируя гомодимер. Ультрацентрифугирование показало, что в отсутствие тековиримата белок в растворе был преимущественно мономерным (коэффициент седиментации 3,4). Добавление препарата сместило равновесие в сторону димерной формы (коэффициент седиментации 4,7), а мономеров обнаружено не было.

Ученые определили концентрацию, необходимую для димеризации 50% sF13, для тековиримата и IMCBH (селективного ингибитора репликации вируса осповакцины — VACV). Она составила 92 нМ и 1475 нМ соответственно. Получается, что тековиримат в растворе примерно в 15 раз активнее, чем IMCBH. Однако измеренная напрямую противовирусная активность тековиримата выше всего в пять раз, что можно объяснить различной проницаемостью мембран для этих препаратов или их различной локализацией в клетке.

Ученые также исследовали мутантные варианты MPXV, резистентные к тековиримату: три были изолированы от пациентов с мпокс, лечившихся этим препаратом, один — выявлен in vitro, но не обнаружен у инфицированных людей. Мутации в клинических штаммах были расположены в интерфейсе димеризации. Растворимые формы белка F13 этих мутантов не образовывали гомодимеры в присутствии тековиримата. Напротив, у мутанта, выявленного in vitro, sF13 образовывал димеры — у него замена располагалась за пределами региона димеризации. Ученые провели эксперименты на клетках HeLa, трансфицированных конструкциями с F13 дикого типа и мутантными формами. Они подтвердили, что тековиримат вызывает димеризацию F13 в клетках, а мутации, придающие устойчивость к нему, нарушают этот процесс.

Наконец, с помощью системы безмаркерной инженерии MAVERICC ученые создали мутант вируса осповакцины с заменой S292F, которая делала гомодимер F13 стабильным, а вирус — нечувствительным к тековиримату. Но мутантный вирус оказался нежизнеспособным, и это дает возможность предположить, что большинство замен в области димеризации белка могут быть критичны для морфогенеза вируса.

В целом результаты исследования объясняют механизм действия тековиримата и позволяют понять, почему некоторые мутации делают противовирусное лечение неэффективным.

«Молекулярный клей» направляет белки на разрушение