Разработан новый метод редактирования генома насекомых

Ученые из Японии и Испании разработали и оценили эффективность нового метода генного редактирования насекомых, который назвали «прямой родительский CRISPR» (direct parental CRISPR, DIPA-CRISPR). Рибонуклеопротеины Cas9 вводятся напрямую в гемоцель самки — пространство между внутренними органами. Эффективность генного редактирования у рыжего таракана составила 21,8%, а у модельного жука Tribolium castaneum 71,4%.

Credit:
123rf.com

В современной практике при редактировании геномов насекомых материал вводится с помощью микроинъекции в ранние эмбрионы. Однако у многих насекомых этот подход не работает. У некоторых видов, например, у тараканов, яйца заключены в твердую оболочку, получить к ним доступ трудно. Поэтому исследователи из Японии и Испании разработали новый подход для генного редактирования насекомых. Они назвали его «прямой родительский CRISPR» (direct parental CRISPR, DIPA-CRISPR). По оценке авторов, он должен работать на 90% всех видов насекомых.

Ученые обнаружили, что прямая инъекция рибонуклеопротеинов Cas9 в гемоцель — пространство между внутренними органами — взрослой самки таракана приводит к возникновению наследуемых мутаций в развивающихся ооцитах. Эффективность подхода продемонстрировали на рыжем таракане Blattella germanica. Изменения вносили в ген cinnabar, отвечающий за цвет глаз.

Изначально эффективность генного редактирования (gene editing efficiency, GEF) — доля потомков с измененным геномом — была невелика и составляла 2,3%. Но варьируя время инъекции относительно репродуктивного цикла самки, ученые повысили GEF до 21,8%. У отдельных самок GEF превышала 40%.

Внесенные изменения наследовались. Двух потомков из первого эксперимента с мозаицизмом скрестили с тараканами дикого типа. В результате 62,2% и 75,0% потомков были гетерозиготами по мутантному аллелю. Дальнейшие эксперименты подтвердили, что внесение DIPA-CRISPR позволяет получать нокаутных тараканов с высокой эффективностью.

Также возможность использования нового метода показали на модельном жуке Tribolium castaneum (хрущак малый булавоусый). Авторы таргетировали ген cardinal, который тоже отвечает за цвет глаз и находится на X-хромосоме. У самцов (генотип XY) изменения в этом гене хорошо видны в первом поколении. Эффективность редактирования была очень высокой и достигала 71,4%, то есть была сравнима с эффективностью прямой микроинъекции в эмбрион. Тараканы и жуки — не родственные виды, поэтому успешность эксперимента говорит об универсальности подхода.

Исследователи также провели эксперимент по получении нокина у жуков T. castaneum. Эффективность была очень низкой (1,2%), авторы говорят о необходимости дальнейших экспериментов по ее увеличению.

В отличие от других методов редактирования геномов насекомых, в DIPA-CRISPR можно использовать покупной Cas9 без модификаций. Это позволяет сделать метод доступным для неспециализированных лабораторий.

Самый важный параметр для успешного генного редактирования — фаза репродуктивного цикла самки. Значит, для адаптации метода к новому виду необходимо разбираться в его вителлогенезе. Из-за особенностей репродукции метод не работает, например, на дрозофиле.

Есть и другие сложности. Так, для DIPA-CRISPR требуется больше реагентов, чем для принятых сейчас методов, что скажется на его цене. При этом цену нельзя снизить за счет уменьшения концентрации Cas9, так как это сильно скажется на эффективности.

Источник

Yu Shirai, et al. DIPA-CRISPR is a simple and accessible method for insect gene editing // Cell Reports Methods (2022), published May 16, 2022, DOI: 10.1016/j.crmeth.2022.100215

Добавить в избранное

Вам будет интересно