Репарация эухроматина может быть фактором онкогенеза

Белки хроматина участвуют в репарации ДНК, позволяя выполнять, например, гомологичную рекомбинацию и негомологичное соединение концов. Но механизмы реакции хроматина на двуцепочечные разрывы изучены недостаточно хорошо.

В норме хроматин организован в топологически ассоциированные домены (TAD), внутри которых участки хроматина сближаются и взаимодействуют намного чаще, чем между доменами. Двуцепочечные разрывы (dual strain breaks, DSB) вызывают реакцию на повреждение ДНК — DDR (DNA Damage Reaction), опосредованную киназами ATM, DNA-PK и нестандартными гистонами γH2AX. Очаги DDR образуют тесные скопления. Потенциально это увеличивает риск нежелательных сшивок ДНК, поэтому полезность такого поведения хроматина при репарации неоднозначна. Авторы новой статьи в Nature детализирует этот процесс с помощью широкого спектра методов.

Сначала исследователи использовали линию клеток человека DIvA, в которой можно индуцировать 80 предопределенных двуцепочечных разрывов гидрокситамоксифеном. Для изучения реакции хроматина на разрывы использовали методы Hi-C, позволяющие зафиксировать и изучить сближения петель хроматина. Было установлено, что внутри доменов, включающих повреждения, взаимодействия сильно учащаются, а междоменные взаимодействия наоборот сильно ослабевают. Ингибирование ATM нарушало экструзию когезиновых петель и таким образом снижало эффект внутридоменного взаимодействия, а ингибирование DNA-PK, наоборот, усиливало его и нарушало восстановление DSB. Данные Hi-C подтвердили ранние свидетельства о том, что участки с DSB сближаются, даже если находятся на разных хромосомах, а при помощи флюоресцентной микроскопии GFP с 53BP1 (белок, участвующий в репарации) установили, что поврежденные участки способны взаимодействовать не только по два, но по три и более.

Метод картирования белков на ДНК ChIP-seq показал, что связывание 53BP1 и другие изменения распространяются на весь TAD. Распределения гистона H1 и РНК-полимеразы показывают, что DSB, произошедшие в эухроматине (активных деспирализованных участках хроматина), сближаются. Известно, что повреждения эухроматина репарируются в основном методом гомологичной рекомбинации, тогда как гетерохроматин восстанавливается негомологичным соединением концов. Метод картирования разрывов BLESS показывает, что распределение способов репарации не зависит от частоты разрывов, а Hi-C — что разрывы почти никогда не вызывают превращения эухроматина в гетерохроматин и обратно. Из этого следует, что в сближающихся очагах DDR происходит преимущественно гомологичная рекомбинация в эухроматине.

Были изучены границы поврежденных доменов. Ранее для них была предложена модель жидкостного разделения фаз LLPS (Liquid-Liquid Phase Separation). От разделения фаз в ядре зависит скорость диффузии низкомолекулярных веществ между доменами, которые в случае с LLPS диффундируют на порядки медленнее. Был применен метод флюоресцентной микроскопии half-FRAP, который после обесцвечивания части объекта позволяет оценить скорость диффузии флюорофора. LLPS обнаруживается в клетках, поврежденных краткосрочным лазерным облучением, через 15 минут, но не в выдержанных в течение четырех часов. Кроме того, скорость движения поврежденных доменов в выдержанных клетках была намного ниже, а в очагах повреждения отсутствовала поли(АДФ-рибоза), обнаруженная в свежеоблученных клетках. (Поли-АДФ-рибозилирование гистонов с помощью фермента PARP-1 необходимо для репарации ДНК.) Эти данные говорят в пользу модели, в которой LLPS способствует накоплению рекрутированных молекул на ранних стадиях, а после завершения сближения домены разделены по типу полимер-полимер (PPPS), что не препятствует диффузии. Смена типа раздела фаз происходит из-за мостовых взаимодействий молекул 53BP1, связанных с хроматином из разных доменов.

Дальнейший анализ Hi-C выявил неповрежденные транскрипционно активные локусы, ассоциированные со сближающимися очагами DDR. Этот хорошо выявляемый и изолированный от остальных доменов хроматин назвали D-компартментом. Неповрежденными генами, входящими в D-компартмент, оказались гены-супрессоры опухоли и гены-мишени p53. Кроме того, в компартменте наблюдалась (qDRIP–seq картирование) повышенная концентрация R-петель, гибридной РНК-ДНК трехцепочечной структуры. Необходимость R-петель для формирования D-компартментов была установлена воздействием на экспрессию ядерной РНКазы.

Многие привлекаемые в D-компартмент гены проявляли повышенную активность. Снижение экспрессии белка SUN2, участвующего в укладке хроматина и необходимого для образования D-компартмента, приводило к отсутствию изменений в регуляции этих генов. Таким образом, формирование D-компартмента нужно для увеличения экспрессии попадающих в него генов.

Хотя D-компартменты и необходимы для репарации эухроматиновой ДНК, в них могут происходить нежелательный сшивки двухцепочечных разрывов, в том числе с участием ктивных генов-супрессоров опухоли и мишеней p53, что увеличивает вероятность рака. Изменения активности большого количества белков, связанных с кластеризацией очагов DDR (SETX, DNA-PK, 53BP1, SUN2, когезин и другие) и последующие определения транслокаций надежно подтвердили, что транслокации значительно учащаются при репарации в D-компартментах.

В доказательство предположения о транслокациях с участием привлекаемых в D-компартмент генов, авторы изучили транслокации в клетках опухоли 1493 раковых больных и выявили значительное пересечение множеств поврежденных и привлеченных генов. Можно заключить, что необходимые процессы, проходящие при репарации эухроматиновой ДНК, могут быть одним из ключевых драйверов онкогенеза, непропорционально увеличивая геномную нестабильность в области генов-супрессоров опухоли и мишеней p53.

Интеграция ВПЧ в клетку-хозяина реорганизует хроматин и стимулирует онкогенез