Сенсор глутамата улавливает переданный нейроном сигнал

Многие нейробиологические исследования опираются на измерение активности тех или иных нейронов. Это важная информация, однако для более глубокого понимания работы мозга необходимо также отслеживать сигналы, приходящие на синапс. И если методы считывания ответа на сигнал в популяции нейронов уже активно применяются — например, флуоресцентные индикаторы кальция или потенциала, — то способов массовой регистрации сигналов, передаваемых в синапс, пока не было создано. Международная группа ученых сконструировала белковый сенсор, позволяющий отслеживать динамику глутамата при передаче сигнала, и применила его для визуализации работы нейронов в мозге мыши.

Основные возбуждающие синапсы в мозге используют глутамат, однако малое количество его молекул и короткое время нахождения в синаптической щели затрудняют измерение сигнала, особенно при одновременном отслеживании многих синапсов in vivo. Флуоресцентный сенсор глутамата iGluSnFR может выявлять высвобождение отдельных синаптических везикул при оптимальных условиях, однако для массовой регистрации его соотношения «сигнал/шум» недостаточно. Исследователи разработали на его основе два высокочувствительных, быстро активирующихся варианта iGluSnFR с быстрой и медленной деактивацией.

Чтобы оптимизировать iGluSnFR, ученые провели мутагенез в 41 сайте, влияющем на функцию этого сенсора (целевые участки определяли по литературным данным). Полученные варианты — в общей сложности 1640 — трансдуцировали в первичные культуры нейронов коры крыс и оценивали их ответ на стимуляцию. По результатам этого скрининга авторы отобрали 12 точечных замен в девяти сайтах, построили полную комбинаторную библиотеку и оценили эффекты замен в различных комбинациях с помощью обобшенной линейной модели. Затем 70 наиболее оптимальных вариантов протестировали in vitro. После нескольких этапов отбора авторы остановились на двух вариантах — v8880 и v9601 — как наиболее перспективных. Их обозначили как iGluSnFR4s и iGluSnFR4f. Константа времени затухания iGluSnFR4f, измеренная на отдельных нейронах, составила 25,9 мс (медианное значение), у iGluSnFR4s — 152,7 мс, то есть в одном случае значительно меньше, а в другом больше, чем у iGluSnFR3. Оба сенсора были способны детектировать сигналы отдельных нейронов.

В качестве быстро меняющихся сигналов, которые можно отслеживать в мозге бодрствующей мыши, ученые выбрали реакцию фолликулов вибрисс (усов). Это важный компонент сенсорного восприятия — грызуны ритмично водят вибриссами с частотой около 15 Гц, чтобы «ощупывать» окружающее пространство. Сигналы из фолликулов поступают в вентральный заднемедиальный таламус (VPM), а оттуда в первичную соматосенсорную кору vS1. Чтобы охарактеризовать глутаматергические сигналы в ответ на стимуляцию, авторы экспрессировали белки-сенсоры в VPM, а затем регистрировали сигнал с помощью прижизненной двухфотонной микроскопии. Измерения проводили во время ритмичной стимуляции воздухом или при спонтанных движениях усами. Стимулы подавали на разных частотах, и iGluSnFR4f демонстрировал был способен обнаруживать реакции на частоте до 20 Гц — выше, чем естественная частота движения усов мышей. Также он в среднем давал более высокую амплитуду сигнала в различных экспериментальных условиях. 

При двухфотонной визуализации ограничения скорости сканирования вынуждают искать компромисс между частотой кадров и объемом визуализации. Авторы оценили, насколько iGluSnFR4 полезен для визуализации зрительной коры мыши в ответ на редкие стимулы. Съемка велась с частотой 30 Гц, и зарегистрированный сигнал объяснял в четыре раза больше дисперсии, чем сигнал исходного сенсора iGluSnFR3. 

Другое важное направление — это волоконная фотометрия, которая включает передачу возбуждающего света и сбор результирующей флуоресценции через оптоволокно. Авторы рассудили, что более медленная кинетика и высокая аффинность iGluSnFR4s особенно хорошо подойдут для таких задач. Они подтвердили это, анализируя реакцию на вознаграждение — в ходе эксперимента мышам, которым временно ограничивали доступ к питью, давали воду. 

Разработанные варианты iGluSnFR с повышенной чувствительностью и измененной кинетикой затухания перспективны для различного in vivo имаджинга передаваемых глутаматергических сигналов. При этом «медленный» и «быстрый» варианты имеют свои ценные области применения — iGluSnFR4f обладает более высокой пространственной специфичностью и подходит для отслеживания высокочастотных сигналов, а iGluSnFR4s, напротив, позволяет интегрировать сигнал во времени при волоконной фотометрии. 

Новый биосенсор на флуоресцентных кумаринах обнаружит болезнь Альцгеймера