Новый биосенсор на флуоресцентных кумаринах обнаружит болезнь Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера (БА) — прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, наиболее распространенная причина деменции. Важную роль в патогенезе БА играют накопление токсичного бета-амилоидного белка (Аβ) и образование амилоидных бляшек в нервной ткани, а также нейрофибриллярные клубки — аномальные скопления гиперфосфорилированных форм тау-белка, который в норме стабилизируют микротрубочки нейронов. (Подробнее на PCR.NEWS.) Есть и другие нейродегенеративные заболевания, в патогенезе которых участвуют амилоидогенные белки (болезни Паркинсона, Гентингтона, различные формы системного амилоидоза). Поэтому технологии идентификации амилоидов расширяет возможности ранней диагностики и лечения пациентов.

Существуют разные методы обнаружения амилоидов, в том числе радиовизуализация in vivo (позитронно-эмиссионная томография и однофотонная эмиссионная компьютерная томография) или флуоресцентные подходы in vitro. Методы радиовизуализации неселективны, не слишком удобны для пациента и плохо подходят для массовых обследований. Для флуоресцентной визуализации используются зонды, распознающие амилоидные структуры (характерные β-складчатые образования, в которых β -слои белка ориентированы перпендикулярно оси фибриллы). Например, тиофлавин Т (ThT), достаточно чувствителен, но не обладает селективностью в отношении различных амилоидных белков. Авторы статьи в ACS Sensors предлагают простой, недорогой и чувствительный метод детекции амилоидов.

Современный подход к флуоресцентной детекции — матрицы, то есть наборы из нескольких флуоресцентных зондов, каждый из которых дает особый сигнал на тот или иной амилоид; таким образом, для разных патогенных белков и различных состояний пациента можно получить уникальные сигнатуры флуоресценции. На данных, собранных с помощью такой матрицы, обучают алгоритмы отличать сигнатуры, связанные с заболеванием. Такой подход позволяет распознавать аналиты в сложных образцах — гомогенатах тканей, спинномозговой жидкости или плазме крови.

Авторы выбрали пять молекул-зондов, способных взаимодействовать с β-структурами амилоидов. Четыре из них содержали бензотиазольные группы (кумарин 6, ThT и две молекулы на основе кумарина, синтезированные специально для этого исследования и обозначенные С2 и С3) и еще одна, тоже производное кумарина (С1), содержала диметиланилиновую и азетидиновую группы. Затем проанализировали флуоресцентную реакцию каждого зонда на амилоидные фибриллы, вовлеченные в патогенез БА (Aβ 40, Aβ42 и Tau4R), а также на инсулин, который содержит β-листы и используется как модель для изучения амилоидов. Матрица безошибочно идентифицировала все четыре белка и различала концентрации, то есть могла быть использована и как инструмент для количественной оценки.

Авторы обратили внимание, что зонды можно разделить на две группы — ThT, C1, C3 в одной, кумарин 6 и C2 в другой, — причем реакции зондов внутри групп коррелируют друг с другом. Это позволяло упростить матрицу, выбрав по одному соединению с самой сильной флуоресценцией из каждой группы. Оказалось, что все исследуемые амилоиды можно детектировать и идентифицировать, используя всего два зонда — кумарин 6 и С1.

Эффективность флуоресцентной матрицы на основе кумарина 6 и С1 проверяли на образцах гомогената головного мозга трансгенных мышей APP/PS1 с болезнью Альцгеймера и мышей дикого типа (WT). Двухсенсорная матрица и алгоритм, обученный на ранее собранной базе данных, успешно отличали образцы мозга, в которых нет отложений амилоида (WT), от образцов больных мышей. Удавалось различить 6- и 12-месячных мышей APP/PS1, то есть раннюю и позднюю стадии болезни. Это демонстрирует потенциал системы как клинического инструмента для диагностики БА и мониторинга эффективности лечения.

Более того, система успешно распознавала амилоиды в среде DMEM — питательной среде для культивирования клеток с добавками аминокислот, витаминов и неорганических солей, которые могут мешать взаимодействию зондов с аналитами.

Наконец, авторы получили уникальные флуоресцентные сигналы для других биологически значимых амилоидных белков— гидрофобинов грибов, которые играют роль в их росте и развитии, а также в заболеваниях человека (аспергиллезе).

Предложенный авторами метод может сократить время пробподготовки и анализа данных, повысить производительность скрининга клинических образцов. Также он имеет потенциал в качестве инструмента для лабораторных исследований.

Тест на биомаркер болезни Альцгеймера в крови по диагностической точности близок к ПЭТ