Создали гибридную платформу на основе Cas9 и Cas12a для функционального скрининга генома

В статье в Nature Biotechnology предложили новое применение CRISPR-технологии для генетического скрининга. Для многих генетических задач требуется внесение в геном парных модификаций — например, для определения функций генов-паралогов или изучения генетической регуляции и взаимодействующих компонентов сигнальных путей. При изучении функций отдельных экзонов, присутствующих не во всех альтернативных изоформах, требуется их точное вырезание с двух сторон.

Новая система CHyMErA (Cas Hybrid for Multiplexed Editing and screening Applications) показала свою эффективность в массовом скрининге влияния двойных модификаций на выживаемость клеток и выявила новые генетические механизмы. CHyMErA основана на коэкспрессии нуклеаз Cas9 и Cas12a вместе с так называемой гибридной гидовой РНК, содержащей последовательности гидовых РНК для Cas9 и Cas12a, экспрессирующиеся под одним промотором.

Необходимость комбинирования двух разных нуклеаз Cas связана с ограничениями, существующими при использовании их по отдельности для парных инактиваций. Так, применение Cas9 с несколькими гидовыми РНК для комбинаторных исследований малоэффективно в силу рекомбинации, происходящей между компонентами векторов, несущих эти РНК. Cas12a имеет РНКазную активность и может производить несколько гидовых РНК из общего химерного предшественника, но эффективность внесения множественных инделов в пределах одной клетки составляет менее 10%.

Авторы новой работы предложили использовать гибридную гидовую РНК (hgRNA), состоящую из гидовой РНК Cas9 к первой мишени и гидовой РНК Cas12a ко второй мишени. Гибридная РНК разрезается на две гидовых РНК за счет РНКазной активности Cas12a, и далее модификации в геном вносятся с помощью Cas9 и Cas12a. Структуру гидовых РНК для Cas12a предварительно оптимизировали с применением сверточных нейронных сетей; для дизайна оптимальных последовательностей разработан компьютерный инструмент CHyMErA-Net.

Исследователи создали библиотеку hgRNA к генам человека с наиболее высокой экспрессией, к парам паралогов, к известным взаимодействующим парам генов, а также контрольные hgRNA к межгенным участкам и трансформировали их в несколько культур клеток человека. Эффективность внесения инделов и вклад конкретного участка генома в выживаемость клетки оценивали по снижению представленности конкретной hgRNA в ряду клеточных поколений. Для этого проводили полногеномное секвенирование на различных стадиях роста клеточной культуры после трансфекции и определяли обогащение hgRNA. Если конкретная hgRNA вносит инделы в жизненно важных генах, это приводит к статистически значимому снижению ее представленности в клеточной популяции, так как несущие ее клетки не делятся или погибают.

С помощью новой платформы ученые выявили взаимозаменяемость ряда паралогичных генов. На это указывало более значительное снижение представленности hgRNA к обоим генам, чем суммарное снижение представленности hgRNA к одиночным паралогам, т. е. влияние отдельных паралогов на выживаемость клетки не аддитивно, а имеет место взаимодействие между ними. Таким образом были выявлены и ранее известные взаимозаменяемые паралоги, и новые.

Кроме того, ученые применили CHyMErA для хемогенетического скрининга и обнаружили неизвестные ранее мишени низкомолекулярного соединения Torin1 — ингибитора пути mTOR.

При изучении альтернативных экзонов CHyMErA позволила выявить 124 экзона, делеция которых значимо снижала представленность соответствующих hgRNA. Среди них — экзон 12А гена BIN1, кодирующего опухолевый супрессор. Эти результаты подтверждают полученные ранее данные об участии этого экзона во взаимодействии BIN1 с протоонкогенами MYC.

По мнению авторов, новая гибридная платформа CHyMErA более эффективна для оценки комбинаторных взаимодействий, чем предложенные ранее системы на основе различных вариантов Cas9, а также позволяет проводить точное делетирование участков генома для определения их роли в пролиферации и выживаемости клеток.