Связанные с антителами сенолитики специфично уничтожают стареющие клетки

Ученые из Великобритании разработали способ уничтожения стареющих клеток организма с помощью таргетированного подхода. Для этого они использовали конъюгат сенолитического препарата и антитела (КПА) против B2M — специфического маркера на поверхности стареющих клеток (СК), экспрессия которого повышается при индуцированном стрессом старении (СИС). КПА связывается с поверхностным антигеном, поглощается клеткой и после расщепления в лизосоме по линкеру высвобождает в цитоплазму токсичный препарат (в данном случае дуокармицин).

Накопление СК может приводить к развитию диабета, рака, болезни Альцгеймера и многим другим заболеваниям. Ранее было показано, что очищение от СК увеличивает продолжительность жизни на моделях in vivo. Это положило начало разработке нового класса препаратов — сенолитиков, которые могут селективно убирать СК из тканей. Однако исследованные на данный момент сенолитики не отличаются высокой специфичностью, поэтому авторы надеются, что таргетный подход окажется более эффективным и безопасным.

Новая статья — продолжение работы исследователей над проблемой борьбы со СК в организме. Вначале ученые описали белки на поверхности клетки, экспрессия которых повышается в процессе старения, а после изучили, насколько эффективно будет применение наночастиц, конъюгированных с теми же антителами против В2М. Также они показали на мышах, что нарушение сигнальных путей, индуцирующих старение, повышает продолжительность жизни, не вызывая при этом канцерогенез.

В настоящей работе ученые использовали в качестве мишени конъюгата белок В2М, относящийся к классу MHC I. Он был выбран из панели возможных маркеров, описанной ранее. Иммуногистохимия показала, что паттерн экспрессии В2М схож с паттерном р16 — классического маркера старения.

Чтобы подтвердить валидность В2М в качестве маркера старения, исследователи использовали модельные клеточные линии карциномы мочевого пузыря EJ. Линии клеток EJp53, EJp21 и EJp16 тетрациклин-зависимо экспрессируют p53, p21 или p16, соответственно. После удаления тетрациклина начинается экспрессия этих белков и запускаются процессы старения. Вестерн-блот и РНК-секвенирование подтвердили увеличение экспрессии В2М на уровне белков и РНК в клетках линии EJp53. Однако экспрессия В2М не изменилась в линии EJp21 и лишь незначительно повысилась в линии EJp16 на уровне белков.

Так как р53 вызывает СИС клеток, это позволяет предположить, что В2М лучше всего отражает именно этот тип старения, и куда хуже — репликативное старение, которое связано с р16-сигналингом.

Для создания КПА были выбраны IgG-антитела. Авторы подтвердили поглощение клеткой моноклональных антител после присоединения к поверхности СК. Далее антитела к В2М конъюгировали с дуокармицином — алкилирующим агентом — с помощью линкера, который расщепляется катепсином B в лизосомах после поглощения конъюгата. В качестве контроля использовался конъюгат дуокармицина с IgG1.

Исследование проводилось на линиях EJp53, EJp16 и EJp21, в которых предварительно индуцировали старение. В качестве положительного контроля использовали линию EJp53, трансфицированную В2М, но без запуска старения. После инкубации EJp53 и EJp16 с разными концентрациями B2M КПА или контрольным IgG1 КПА ученые подсчитывали жизнеспособность клеток с помощью Cell Titre Glo и PI-окрашивания.

Стареющие EJp53 были чувствительны к B2M КПА, но не к IgG1 КПА. Такие же результаты наблюдались и на линии положительного контроля, что подтверждает тот факт, что токсичность КПА зависит только от экспрессии B2M. EJp53 без индуцированного старения и без экспрессии B2M не отвечала на B2M КПА.

Клетки EJp16 даже с запущенным старением не были чувствительны к B2M КПА, вероятно потому, что эти клетки экспрессируют куда меньшее количество B2M. Как и ожидалось, B2M КПА также не оказал никакого цитотоксического эффекта на EJp21, где запускаемое р21 старение не отражается на экспрессии В2М.

Ученые также проверили эффективность B2M КПА на линии HCT116, классической модели для изучения р53-зависимого СИС, чтобы подтвердить, что B2M КАП успешно избавляется от любых клеток, которые уходят в СИС. Старение было индуцировано инкубацией с доксорубицином в течение четырех дней, после чего наблюдалось повышение экспрессии B2M. B2M КПА вызвал смерть стареющих клеток, но не «молодых» контрольных. Исследователи также провели окрашивание аннексином V, что показало, что смерть клеток, вызываемая B2M КПА, не апоптотическая, и скорее некротическая.

Полученные результаты показывают, что B2M КПА можно использовать в качестве таргетного сенолитика в случае р53-зависимого СИС. Это позволяет предложить новый подход к уничтожению СК, который может стать успешным при клинических исследованиях заболеваний с патологическим старением и сопутствующих болезней.