Ткань, напечатанная на 3D-принтере, секретирует инсулин в ответ на глюкозу

Проблема, которую необходимо решить, чтобы преодолеть ограничение на размеры конструкций 3D-биопечати, — формирование сосудистой системы, которая обеспечивала бы снабжение напечатанной ткани кислородом и питательными веществами. Миниатюрные модели человеческих органов и тканей (органы-на-чипе) решают проблему циркуляции, но подложка и каналы выполнены из искусственных материалов, и эти конструкции далеки по свойствам от естественных аналогов.

Лаборатория Адама Фейнберга в Университете Карнеги — Меллона использовала свою новую технологию 3D-биопечати — Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH), чтобы создать первую в своем роде модель ткани, полностью состоящую из коллагена. Предполагается, что такие конструкции будут более сходными с естественными, и их можно будет использовать не только в исследовательских целях, но и, например, для терапии диабета 1 типа.

Структуры, которые авторы напечатали белками внеклеточного матрикса (ВКМ) и клетками, они назвали «внутренне перфузируемые каркасы с высоким разрешением на основе коллагена» (collagen-based high-resolution internally perfusable scaffolds, CHIPS). Для культивирования и перфузии мягкой напечатанной ткани была сконструирована биореакторная система VAPOR (vascular and perfusion organ-on-a-chip reactor).

CHIPS печатаются посредством экструзии биоматериала в поддерживающую ванночку с желатином, который иммобилизует нить из биочернил и способствует ее отверждению. Когда печать закончена, желатин удаляют нагреванием до 37 °С.

Технологию FRESH авторы ранее уже использовали для создания 3D-структур (например, тканей сердца), но для создания внутренних каналов с хорошей проницаемостью стенок потребовались модификации, прежде всего улучшение точности позиционирования при печати. В новой работе авторы описали напечатанную сосудистую сеть, диаметр сосудов которой уменьшался при разветвлениях от 750 мкм до 500 и 250 мкм, причем сохранялись проходимость и целостность; среднее отклонение от заданных размеров не превышало 11 мкм. Эксперименты с флуоресцирующими жидкостями показали, что молекулы различного размера могут диффундировать из сосудов CHIPS в основной объем каркаса; в подавляющем большинстве микрофлюидных систем и органах-на-чипе из полидиметилсилоксана или пластиков это невозможно.

Чтобы обеспечить правильное пространственное расположение клеток в матриксе, авторы создали систему для многокомпонентной FRESH-печати с экструдерами для различных биоматериалов. Эта система позволяла печатать вдоль просвета канала тонкий слой коллагена и фибронектин — гликопротеин, играющий важную роль в клеточной адгезии, к которому прикрепляются эндотелиальные клетки, — или коллаген с фактором роста эндотелия сосудов и фибронектином. Но клетки эндотелия пупочной вены человека, посеянные в такие каналы, не формировали надежного монослоя. Тогда авторы дополнили свою систему многокомпонентной печати биочернилами на основе фибрина, содержащими эндотелиальные клетки из пупочной вены и мезенхимальные стволовые клетки из костного мозга человека. Этот подход оказался более удачным. (Они особо отмечают, что эти чернила уже не содержали VEGF, что дало возможность оценить поведение клеток в отсутствие экзогенных факторов роста.)

Затем авторы сконструировали еще более сложную клеточную систему CHIPS, способную секретировать белки, — аналог островков поджелудочной железы, секретирующих инсулин в ответ на рост концентрации глюкозы. Для этого в состав «сосудистых» биочернил с эндотелиальными и мезенхимальными стволовыми клетками добавили мышиные клетки MIN6, функционально сходные с человеческими бета-клетками поджелудочной железы.

В полученной трехмерной структуре клетки MIN6 продуцировали инсулин в ответ на глюкозу, экспрессировался белок клеточной адгезии, что говорило об образовании капилляроподобных сетей, а миграция клеток определялась углом напечатанных коллагеновых нитей. После 12-дневной перфузии в биореакторе, отмечают авторы, одним из самых интересных наблюдений было появление петлеобразных структур, содержащих инсулин-положительные клетки MIN6 и актин-положительные эндотелиальные клетки и (или) мезенхимальные стволовые клетки; эти структуры напоминали ранний морфогенез поджелудочной железы во время развития островков.

Итак, в одноэтапном процессе биопечати получена конструкция сантиметровых размеров, способная к производить инсулин. Авторы отмечают, что биофлюидные устройства, изготовляемые методом фотолитографии, позволяют изготавливать более мелкие элементы, с размерами в десятки микрометров, которые сложно воспроизвести с помощью экструзионной печати. Нижний предел для созданных с ее помощью каналов — около 100 мкм в диаметре, однако это ограничение связано скорее с размером микрочастиц желатина. С более мелкими частицами его удастся понизить до 50 мкм. Кроме того, как показал эксперимент, клетки в составе 3D-структуры могут мигрировать вдоль нитей коллагена и самостоятельно организовываться в более мелкие сосуды. Еще один плюс новой технологии — возможность формировать клеточные паттерны в замкнутых полостях, что принципиально невозможно при перфузионном засеивании напечатанного каркаса.

Коммерциализацией технологии занимается FluidForm Bio, спинаут Университета Карнеги — Меллона, который на момент публикации статьи в Science Advances проводит краудфандинговую кампанию. FluidForm Bio продемонстрировала на животных возможности лечения диабета 1 типа и планирует в ближайшие годы начать клинические исследования с участием пациентов, сообщается в пресс-релизе университета.

В то же время авторы исследования стремятся к тому, чтобы их разработки (например, система оптического выравнивания игл принтера для биопечати с открытым исходным кодом, инструкция по изготовлению биореактора) широко использовались для исследований различных тканей и органов и поиска новых применений для технологии.

Биопечать опухолевых органоидов поможет быстро выявить чувствительность к лекарствам

Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы вместе с клетками пуповины