Вирус Эбола проникает в клетки благодаря диссоциации структур из белка VP40

Вирус Эбола (EBOV) — это высокопатогенный РНК-содержащий вирус, который вызывает очень опасную геморрагическую лихорадку у людей и высших приматов. Известно, что EBOV формируют нитевидные вирионы, форма и стабильность которых определяются матриксным вирусным белком 40 (VP40), а слияние вирусной и эндосомальной мембран опосредуется поверхностным гликопротеином (GP). VP40 взаимодействует с отрицательно заряженными липидами, собираясь в квази-спиральную структуру под вирусной мембраной. Из предыдущих исследований известно, что вирусные частицы проникают в клетки путем макропиноцитоза и попадают в цитозоль в поздних эндосомальных компартментах. Слияние вирусной и эндосомальной мембран приводит к высвобождению вирусного генома в цитоплазму. EBOV требуется низкий рН эндосомы для попадания в цитозоль: кислая среда может служить одним из триггеров для обнажения вириона. Хотя структура вирионов EBOV подробно охарактеризована, в настоящее время не установлена роль основного белка вириона VP40 в процессе деградации вирусной оболочки и проникновения в клетку. Понимание молекулярных основ этих процессов важно для предупреждения и остановки распространения этой высоколетальной инфекции.

Для выяснения механизмов проникновения EBOV в клетку исследователи использовали криоэлектронную томографию (ЭКТ), моделирование мембран, липидомику и покадровую флуоресцентную визуализацию. На первом этапе экспериментов ученые заразили вирусом Zaire ebolavirus (штамм Mayinga) клетки линии печени человека Huh7. Спустя 48 часов после заражения проводилась ЭКТ эндосомальных компартментов, содержащих вирионы EBOV. Вирионы Эболы в поздних эндосомах сохранили нитевидную форму и имели конденсированные нуклеокапсиды диаметром примерно 20 нм. Однако матричный слой VP40 был отделен от оболочки, о чем свидетельствуют как пустое пространство, прилегающее к вирусной мембране, так и неупорядоченные скопления диссоциированного VP40, окружающие нуклеокапсид. Авторы показали, что разборка VP40 предшествует слиянию мембран, в то время как целостность нуклеокапсида сохраняется до тех пор, пока не завершится проникновение вируса в цитоплазму.

Затем ученые определили факторы, влияющие на разборку VP40. Поскольку попадание EBOV в клетку происходит через поздние эндосомы, для которых характерен низкий уровень pH, исследователи оценили влияние внешнего уровня кислотности среды на форму вирусоподобных частиц (VLP) EBOV, в частности, на структуру из белка VP40. VLP, состоящие из VP40 и GP, были получены из клеток HEK 293T (клетки эмбриональных почек человека) и проанализированы с помощью ЭКТ. Выяснилось, что при нейтральном pH белки VP40 образовывали спиральную структуру, прилегая ко внутренней мембране. Димеры VP40 напрямую соединяются с монослоем внутренней мембраны с помощью С-концевого домена белка.

При снижении рН до 4,5 VLP сохраняли нитевидную структуру. Но ученые наблюдали, что VP40 отделялся от мембраны и образовывал отдельные агрегаты, которые сосредоточивались в центре VLP. При использовании частиц, состоящих из VP40, GP и нуклеокапсидных белков NP, VP24 и VP35 наблюдалась схожая реакция на снидение рН. Следовательно, диссоциация VP40 происходит в кислой среде и не зависит от других вирусных белков, включая трансмембранный GP.

Ученые дополнительно исследовали взаимодействия VP40 с липидами мембран в нейтральной и кислой среде. Для этого они сконструировали упрощенную модель монослоя внутренней мембраны VLP с отрицательным зарядом, а также С-концевые остатки (CTD) VP40, которые непосредственно связываются с липидами. Затем авторы смоделировали взаимодействия VP40 с мембраной в течение 10 микросекунд для каждого уровня рН с помощью силового поля CHARMM36m. Было показано, что после связывания одного CTD димера VP40 с фосфатидилсериновыми остатками, второй CTD притягивается к мембране. Это приводит к закреплению димера в липидном слое за счет положительно заряженных остатков лизина в составе С-концевых доменов. Напротив, в кислой среде сродство VP40 к липидным компонентам мембраны значительно снижалось, однако связывание не было полностью ингибировано, так как 10% фосфатидилсеринов оставались заряженными.

Чтобы определить, какие липиды входят в состав мембран VLP и участвуют в связывании VP40, авторы использовали масс-спектрометрию. Оболочка вирусоподобной частицы содержала фосфатидилсерин, холестерин, фосфатидилхолин и сфингомиелин (9%, 39%, 25% и 9% соответственно), которые способны устанавливать электростатические взаимодействия. Ученые доказали, что отделение VP40 от мембраны обусловлено нейтрализацией отрицательно заряженных фосфолипидов при низком рН эндосом.

При оценке проницаемости ионов через мембрану VLP авторы использовали рН-чувствительные флуоресцентные метки GFP pHluorin, связанные с N-концами VP40. С помощью покадровой микроскопии ученые отслеживали время обесцвечивания метки в нитевидных и сферических вирусоподобных частицах. При нейтральном pH VLP демонстрировали постепенное обесцвечивание метки в течение нескольких минут. Однако когда ученые использовали детергент Triton X-100, нарушающий целостность мембран, сигнал затухал всего за 15 секунд. Это говорит о том, что протонирование pHluorin замедляется мембраной VLP. Затем с помощью калибровочной кривой авторы вычислили уровень pH внутри частиц и определили кинетику закисления внутренней среды VLP. Оказалось, что скорость проникновения протонов через мембрану сильно зависит от геометрических характеристик частиц: у нитевидных моделей она составляла 1,2 ± 0,2 Å/с, а у сферических – 33 ± 9 Å/с. Сферические вирионы EBOV преимущественно высвобождаются за очень поздних сроках заражения (через 4 дня после заражения) и менее заразны, чем нитевидные частицы. Ученые предполагают, что свойства их мембран, включая протонную проницаемость, являются результатом неправильного формирования частиц из-за истощения клеток.

Также авторы предположили, что разборка структуры из белков VP40 влияет на GP-опосредованное слияние вирионов и поздних эндосом. Чтобы проверить эту гипотезу, авторы смоделировали процесс объединения мембран в присутствии VP40 и оценили величину основных энергетических барьеров — образования стебля, гемифузионной диафрагмы и поры слияния. Выяснилось, что интактная, то есть не подвергшаяся влиянию низкого рН структура VP40 препятствует образованию стеблей гемифузии (процесс взаимопроникновения липидных слоев). Однако после образования стебля присутствие VP40 может способствовать формированию поры слияния за счет увеличения напряжения в гемифузионной диафрагме, так как энергетический барьер для образования поры в этом случае снижается. Исследователи пришли к выводу, что минимальная энергия открытия пор находится на границе фаз между «рыхлой» и «плотно» конфигурациями связей между липидами и VP40, где напряжение диафрагмы максимально. Чтобы экспериментально подтвердить теоретическую модель, авторы инфицировали клетки Huh7 вирусоподобными частицами, содержащими GP, VP40 и бета-лакатамазы с флуоресцентными метками. Поскольку для слияния вирусных и эндосомальных мембран необходим протеолитический процессинг поверхностного GP в кислой среде, ученые использовали обработку термолизином, который активен при нормальном рН (в отличие от катепсина, обеспечивающего этот процесс in vivo). Cами по себе процессинг GP и закисление окружающей среды недостаточны для проникновения вируса в клетку. Целостность структуры из белков VP40 модулирует GP-опосредованное слияние мембран, то есть вполне вероятно, что разборка этой структуры необходима для слияния мембран.

Таким образом, нарушение структур из белков VP40 и их сродства к фосфолипидам при низком рН обеспечивает GP-опосредованное слияние мембран поздних эндосом и вирусных частиц. Ученые выяснили, что вирус Эбола проникает в клетки через мембранные поры. Понимание механизмов их образования может помочь разработать лекарственные средства, которые блокируют этот процесс и предотвращают размножение вируса в организме.

10 эндемических инфекционных заболеваний