Внеклеточные везикулы в крови молодых мышей обладают омолаживающим эффектом

Парабиоз — это метод искусственного соединения животных, при котором между ними устанавливается общее кровообращение. При гетерохронном парабиозе таким образом соединяют двух животных разного возраста. Эксперименты по гетерохронному парабиозу, при котором вместе соединяли старых и молодых мышей, показали, что кровь молодых мышей способна омолаживать мозг, сердце, печень, поджелудочную железу, почки, скелетные мышцы и кости старых мышей. Это влияние прежде всего компонентов плазмы крови молодых мышей. Исследователи из Китая показали, что омолаживающим эффектом обладают малые внеклеточные везикулы (мВВ) — мембранные везикулы диаметром меньше 200 нм, которые состоят из липидного бислоя со встроенными в него белками и содержат белки, РНК и ДНК.

Авторы работы разработали специальный протокол для выделения мВВ из плазмы крови молодых (2 месяца) и старых (20 месяцев) мышей. По морфологии, размеру и представленным поверхностным маркерам (CD9, CD63, Alix, TSG101) эти мВВ оказались одинаковыми. Для оценки влияния мВВ на организм мышей ученые внутривенно вводили старым мышам либо фосфатно-солевой буфер, либо «молодые» мВВ и анализировали состояние разных органов. Аналогично, ученые вводили «старые» мВВ молодым мышам. Далее, чтобы более детально определить функции мВВ, исследователи проводили с ними эксперименты in vitro на клеточных культурах, а также подробнее рассматривали груз, несомый «молодыми» и «старыми» мВВ.

Если старым мышам постоянно вводили «молодые» мВВ раз в неделю, их продолжительность жизни увеличивалась в среднем на 12,42%. Такие мыши выглядели более здоровыми по сравнению с контрольными старыми мышами: у них не наблюдалось ни седины, ни потери шерсти. Введение «молодых» мВВ повышало фертильность старых самцов, улучшало метаболизм, здоровье сердечно-сосудистой системы (по результатам ЭКГ) старых мышей, предотвращало потерю костной ткани и атрофию гиппокампа и коры головного мозга.

Даже кратковременное введение «молодых» мВВ (7 раз за 2 недели) значительно улучшало когнитивные способности и выносливость старых мышей. Способность к обучению и память, за которые отвечает гиппокамп, ученые проверяли в эксперименте с водным лабиринтом Морриса. В нем животных помещают в большой бассейн, заполненный водой, и мышам нужно попытаться найти скрытую платформу, которая позволит им выбраться из воды. Старым мышам эта задача дается труднее, чем молодым, что указывает на ухудшение пространственного обучения и памяти. Однако после введения «молодых» мВВ показатели старых мышей в этом тесте улучшались.

Ассоциативную память, за которую также отвечает гиппокамп, проверяли в эксперименте по обуславливанию контекстуального страха (fear conditioning). В этом тесте животных помещают в особую установку, в которой им позволяют освоиться, а потом дают короткий удар током; при повторном попадании в эту установку мыши должны замирать от страха, помня о том, что их может ударить током. Старые мыши, в отличие от молодых, меньше замирали в этой установке, что указывает на ухудшение ассоциативной памяти. Она улучшалась после введения им «молодых» мВВ.

Выносливость животных проверяли с использованием беговой дорожки, на которой постепенно увеличивалась скорость. Молодые мыши могли пробежать на такой дороже больше 30 минут до наступления изнеможения, а старые — до 20 минут. После введения им «молодых» мВВ старые мыши могли бежать на дорожке около получаса.

Введение молодым мышам «старых» мВВ дало противоположные результаты. Они хуже справлялись с водным лабиринтом Морриса, у них ухудшалась ассоциативная память в тесте по обуславливанию страха, а их выносливость значительно снижалась.

Оказалось, что «молодые» мВВ могут воздействовать напрямую на стареющие (сенесцентные) клетки. Для таких клеток характерна повышенная экспрессия β-галактозидазы, ингибиторов клеточного цикла p21 и p16, а также сниженная экспрессия Ki67 — маркера пролиферации клеток. Также в сенесцентных клетках накапливаются конечные продукты гликирования (AGE) и пигмент липофусцин. Сенесцентные клетки старых мышей после введения «молодых» мВВ теряли фенотип, описанный выше.

Чтобы понять механизм действия «молодых» мВВ, ученые проанализировали протеомы восьми тканей старых мышей, которым вводили такие мВВ. Всего ученые рассмотрели 14 474 белка и выделили кластеры дифференциально экспрессируемых белков с разными функциями. В основном изменялась экспрессия белков, ассоциированных с дисфункцией митохондрий, эпигенетикой и геномной нестабильностью — все эти процессы связаны со старением. Следовательно, омолаживающий эффект мВВ может быть обусловлен сразу несколькими механизмами.

Исследователи подробнее рассмотрели влияние «молодых» мВВ на митохондрии. У старых мышей снижалась скорость синтеза АТФ и активность дыхательного комплекса V в клетках гиппокампа и мышц, а после инъекции «молодых» мВВ эти параметры восстанавливались. Также в клетках органов старых мышей было меньше митохондрий, о чем говорит снижение числа копий митохондриальной ДНК. Вместе с тем в их клетках накапливались аномальные митохондрии — разбухшие или разрушенные. Инъекции «молодых» мВВ, опять же, восстанавливали число нормальных митохондрий. Напротив, инъекции «старых» мВВ молодым мышам приводили к снижению синтеза АТФ, активности дыхательных цепей и копийности митохондриальной ДНК в клетках гиппокампа и мышц животных.

Эксперименты на клетках показали, что «молодые» мВВ могут улучшать дыхательную активность клеток. Опыты проводились на нейроэпителиальных клетках линии NE-4C и миогенных клетках линии C2C12. Обработка «молодыми» мВВ повышала скорость синтеза АТФ, активность дыхательных цепей и копийность митохондриальной ДНК. В таких клетках также повышалась скорость потребления кислорода — мера окислительного фосфорилирования и митохондриального дыхания. «Молодые» мВВ предотвращали сенесценцию клеток, понижая экспрессию p21, и способствовали их пролиферации. «Молодые» мВВ также решали проблему митохондриальной дисфункции в клетках, в которых искусственно вызывали сенесценцию через обработку перекисью водорода.

Интересно, что все описанные выше эффекты «молодых» мВВ не зависели от их источника — мыши или человека. Человеческие «молодые» мВВ также омолаживали мышей и клеточные линии.

Действие мВВ ученые связали с несомым ими грузом, в частности, микроРНК. «Молодые» мВВ несут miR-144-3p, miR-149-5p и miR-455-3p, а «старые» — miR-29a-3p, miR-29c-3p и miR-34a-5p. Клетки тканей могут поглощать мВВ и содержащиеся в них зрелые микроРНК. При этом все «старые» микроРНК могут снижать экспрессию PGC-1α — белка, который регулирует биогенез митохондрий и их функции. Напротив, «молодые» микроРНК подавляют экспрессию APP (белка-предшественника амилоида), PARP-2 и HIF1an (ингибитора HIF-1α), который находится в обратной зависимости с PGC-1α. Таким образом, «молодые» микроРНК косвенно стимулируют экспрессию PGC-1α. Исследователи подтвердили, что после инъекции «молодых» мВВ в клетках гиппокампа и мышц старых мышей повышается экспрессия PGC-1α, а после инъекции «старых» мВВ она, напротив, снижается.

Важность микроРНК в мВВ подтвердили дополнительными экспериментами на клетках. Когда их трансфицировали миРНК против PGC-1α, то обработка «молодыми» мВВ не давала того же благоприятного воздействия на митохондрии. Когда сами мВВ предварительно обрабатывали Triton X-100 для пермеабилизации мембраны и РНКазой, то положительного эффекта тоже не наблюдалось. Блокирование функций микроРНК с помощью антисенс-олигонуклеотидов оказывало то же влияние. Аналогичным образом ученые доказали действие «старых» микроРНК, содержащихся в мВВ.

Таким образом, ученые выяснили, что омолаживающее действие мВВ, полученных из плазмы крови молодых мышей, достигается через микроРНК miR-144-3p, miR-149-5p и miR-455-3p, которые стимулируют экспрессию белка PGC-1α, способствуя биогенезу митохондрий и повышению активности дыхательных цепей. Напротив, мВВ, полученные из плазмы старых мышей, содержат микроРНК miR-29a-3p, miR-29c-3p и miR-34a-5p, которые подавляют PGC-1α и способствуют митохондриальной дисфункции, ассоциированной со старением.

Ускоренное старение отдельных органов повышает риски заболеваний