Заякоренные на микрочастицах цитокины привлекают иммунные клетки в «холодные» опухоли

Ингибиторы контрольных точек иммунного ответа малоэффективны для лечения «холодных» опухолей с низкой инфильтрацией иммунных клеток. Для привлечения иммунных клеток в такие опухоли можно использовать провоспалительные цитокины, однако их системное введение приводит к цитокиновому шторму. При локальном введении цитокинов они всего за несколько минут попадают в кровоток из-за малой молекулярной массы, а наночастицы, загруженные цитокинами, недолго задерживаются в опухолях. Американские ученые разработали новый подход к доставке цитокинов в опухоль с использованием микрочастиц, который позволил задержать их в опухолевом окружении и привлечь иммунные клетки.

Исследователи использовали коммерчески доступные гибридные белки, представляющие собой цитокины, соединенные с Fc-доменом иммуноглобулина. Они конъюгировали полистироловые микрочастицы с Fc-связывающим белком (FcBP). Инкубация таких микрочастиц с Fc-цитокинами приводила к их нековалентному связыванию. Далее ученые протестировали комбинированную терапию (антитела, блокирующих иммунные контрольные точки, и Fc-цитокины на частицах) на нескольких животных моделях опухолей.

Ученые выяснили, что для эффективного накопления частиц с Fc-цитокинами в опухоли требуется использовать микрочастицы. Обычно для доставки лекарств используются малые частицы, так как это облегчает их интернализацию, однако в случае доставки цитокинов в этом нет необходимости — они взаимодействуют с поверхностными рецепторами. В опухолях нарушено строение сосудов, в которых образуются поры (более 200 нм), так что частицы должны быть достаточно большими, чтобы не произошел их быстрый клиренс. Эксперименты с частицами разных размеров, несущими Fc-цитокины, показали, что наиболее эффективны частицы с диаметром 1 мкм. После единственной инъекции они задерживались в опухоли больше недели.

Такой метод доставки цитокинов позволил снизить их системную токсичность. Когда мышам с меланомой линии B16F10 в опухоль доставляли либо частицы с Fc-IL-12 и Fc-IL-15, либо свободные белки, то в первом случае уровень IL-12 и других цитокинов в крови животных был значительно ниже. Гистологические исследования также не выявили следов повреждений органов, которые могли бы быть вызваны цитокиновым штормом.

Далее исследователи проверили эффективность комбинации частиц с Fc-IL-12 и антител к иммунным контрольным точкам. В качестве моделей использовали «холодные» мышиные опухоли — рак молочной железы 4T1 и меланому B16F10. Мышам с опухолью молочной железы вводили частицы с Fc-IL-12, а также антитела против CTLA-4 и PD-1. Это позволило добиться полной ремиссии за 60 дней без системной токсичности. Провокационную пробу, при которой мышам повторно прививали клетки 4T1, животные отвергли, а на 90-й день после инъекции в лимфоузлах животных было больше CD8+ Т-клеток памяти, чем у контрольной группы. Также мышам, прошедшим через терапию, внутривенно вводили клетки 4T1, чтобы спровоцировать образование метастазов. У них не развились метастазы легких, и все мыши прожили еще более четырех недель. Таким образом, комбинированная терапия не только позволила уничтожить опухоль, но и привела к формированию сильной иммунологической памяти.

У мышей с меланомой B16F10, однако, комбинация частиц с Fc-IL-12, анти-PD-1 и анти-CTLA-4 антител лишь незначительно замедлила рост опухоли. Чтобы повысить эффективность терапии, ученые дополнительно использовали частицы с Fc-IL-15, которое вместе с IL-12 повышает противоопухолевый иммунный ответ, и анти-TYRP-1 антитело TA99, которое замедляет рост меланомы. Таким образом, мышам с меланомой B16F10 вводили в опухоль частицы с Fc-IL-12 и Fc-IL-15, а также TA99 и анти-PD-1 и анти-CTLA-4 антитела. Это позволило значительно замедлить рост опухоли и увеличить выживаемость мышей, причем 2 из 10 животных достигли полной ремиссии в течение 80 дней, хотя у полностью излечившихся мышей на месте меланомы осталось витилиго. Такая комбинированная терапия также не имела системной токсичности.

Чтобы лучше оценить эффект от применения комбинированной терапии, ученые проанализировали содержание цитокинов и хемокинов в лизатах опухолей, а также использовали проточную цитометрию для исследования инфильтратов иммунных клеток. В обоих случаях — и в случае мышей с меланомой, и в случае мышей с раком молочной железы — в лизатах опухолей был повышен уровень провоспалительных цитокинов, в том числе TNF-α, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-6. Также увеличивалась инфильтрация эффекторных Т-клеток и NK-клеток в опухоли. При этом в опухолях чаще встречались цитотоксические CD8+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки памяти и дендритные клетки, в то время как Т-регуляторные клетки и макрофаги встречались реже. Это подтвердило, что комбинированная терапия способствовала образованию противоопухолевого иммунного ответа.

Истощение Т-лимфоцитов в опухолевом окружении часто становится причиной резистентности к ингибиторам контрольных точек иммунного ответа. Локальное введение предложенной комбинированной терапии позволило «придать новые силы» истощенным Т-клеткам в окружении опухоли. После локального введения комбинированной терапии CD8+ Т-клетки были больше склонны к пролиферации и выработке цитотоксических агентов, включая IFN-γ, TNF-α и гранзим B. При этом среди истощенных Т-лимфоциты реже встречались терминально истощенные клетки, которые не могут самообновляться, но преобладали истощенные клетки-предшественники, способные «восполнить» энергию.

Привитые мышам опухоли недостаточно близко моделируют человеческие опухоли, поэтому исследователи также показали эффективность комбинированной терапии на генетически модифицированных животных. Для этого использовали мышей линии MMTV-PyMT, у которых развивается инвазивная карцинома протоков молочной железы и часто встречаются метастазы в легких. Локальное введение частиц с Fc-IL-12 и Fc-IL-15, а также анти-CTLA-4 и анти-PD-1 антител повышало выживаемость мышей по сравнению с группами, которые получали только антитела, только IL-12 или комбинацию частиц Fc-IL-12 и антител. У таких животных также сокращалась опухолевая масса.

Для моделирования меланомы ученые использовали животных с нокаутом по онкосупрессору Pten и с онкогенной мутацией в гене Braf в меланоцитах. Применение только ингибиторов контрольных точек иммунного ответа снижало рост таких меланом лишь незначительно, а локальное введение частиц с Fc-IL-12 и Fc-IL-15 вместе с анти-CTLA-4 и анти-PD-1 антителами сильно замедляло образование и рост опухолей, а также увеличивало выживаемость животных.

Таким образом, заякоренные на микрочастицах Fc-цитокины, доставляемые прямо в опухоли, повышали эффективность ингибиторов контрольных точек иммунитета даже в иммунологически «холодных» опухолях. В будущем исследователи планируют заменить неразлагаемые полистироловые частицы на крупные липосомы, чтобы повысить биосовместимость препарата.

Новый онколитический вирус увеличивает эффективность иммунотерапии рака