«ЭпиВакКорона» защищает от коронавируса. Или нет

Практически одновременно появились две публикации: статья о клинических исследованиях вакцины «ЭпиВакКорона» в российском рецензируемом журнале — и открытое письмо участников КИ, проводящих собственное исследование. Есть проблема: в статье говорится, что нейтрализующие вирус антитела образовались у всех участников, а в «народных» экспериментах — не образовались ни у одного. Как это понимать?

Изображение:

Один из методов оценки количества жизнеспособного вируса SARS-CoV-2 в образце: оно пропорционально числу бляшек в клеточном монослое

Credit:

Curr Protoc Microbiol. 2020 | CC BY-NC-ND 4.0

Долгожданное событие: результаты фазы 1-2 клинических испытаний вакцины «ЭпиВакКорона» против COVID-19, разработанной ГНЦ ВиБ «Вектор» Роспотребнадзора, опубликовал журнал «Инфекция и иммунитет». Журнал намного менее престижный, чем The Lancet, в котором публиковались разработчики Гам-КОВИД-Вак. Двухлетний импакт-фактор по РИНЦ для «Инфекции и иммунитет» — 0,775.

Так или иначе, теперь есть более подробная информация о вакцине: детальное описание подбора участников, критериев включения, порядка вакцинации, побочных эффектов (очень незначительных). И главное — особенности гуморального ответа, то есть выработка антител.

Из чего сделана вакцина

До сих пор источниками информации были интервью сотрудников «Вектора»и в СМИ, описания изобретений к патентам ( 1, 2, 3), а также ответы разработчиков на вопросы участников КИ: в феврале и марте. Из патентов удалось узнать, какие именно участки аминокислотной последовательности S-белка выбраны для испытаний на животных и затем для «человеческой» вакцины: тайны в этом вроде бы нет, но это нигде не озвучивалось.

В описании к патенту № 2 743 595 названы участки S454-477, S1179-1200, S1189-1209, то есть один пептид из рецепторсвязывающего домена RBD субъединицы S1 и два перекрывающихся — из субъединицы S2. Числа — это номера аминокислот в S-белке коронавируса, том самом, который в виде тримера образует «шипы» вируса и связывается с клеточным рецептором ACE2.

Специалисты, не участвовавшие в разработке, задавались вопросом, как были выбраны эти пептиды и почему именно они. Детального ответа на него в публикации нет. Сказано, что использовался «дизайн in silico пептидных фрагментов, представляющих известные вирусные антигены» и самые эффективные комбинации были отобраны в экспериментах на животных. Сказано также, что учитывались данные о хорошо изученном S-белке SARS-CoV-1; напомним, что разработка вакцины была начата год назад, когда о новом коронавирусе знали намного меньше, чем сейчас. Исключались эпитопы, связанные с возможным антителозависимым усилением инфекции, а также эпитопы, сходные с участками белков человека. (Антителозависимое усиление инфекции — редкое явление, когда антитело, связываясь с вирусом, способствует не его уничтожению, а его проникновению в иммунные клетки. Признаки АЗУИ наблюдали в экспериментальных условиях для других коронавирусов, и многие опасались, что оно возможно и для SARS-CoV-2.) Также отдавали предпочтение наиболее консервативным участкам белка, которые с наименьшей вероятностью будут затронуты мутациями.

Связывание антитела с рецепторсвязывающим доменом, конечно, может помешать вирусу взаимодействовать с клеткой (хотя не все эпитопы в рецепторсвязывающем домене RBD являются нейтрализующими). Роль эпитопов из S2 («ножки» S-белка) не вполне ясна, возможно, связывание антител с этими участками препятствует слиянию мембран вируса и клетки. Но с пептидами S1179-1200, S1189-1209 есть еще одна сложность: они содержат сайт гликозилирования, то есть аминокислоту, к которой в белке вируса прикреплена углеводная цепочка. На синтетическом пептиде в составе вакцины его, естественно, нет, отсюда вопрос: будут ли антитела к пептиду с сайтом гликозилирования, но без углевода корректно распознавать вирусный белок.

Чтобы быть иммуногенной, молекула должна быть достаточно большой, поэтому короткий пептид ковалентно присоединяют к белку-носителю. Эту конструкцию сорбируют на адъювант (гидроксид алюминия). В экспериментах на животных роль белка-носителя выполнял гемоцианин лимфы моллюска (KLH) — мощный активатор Т-хелперных клеток, хорошо известный иммуностимулирующими свойствами. Он входил в состав вакцины «ЭпиВакЭбола». Однако в вакцине «ЭпиВакКорона» использовали другой белок-носитель — химерный белок, наработанный в кишечной палочке, который включает полную последовательность нуклеокапсида (N-белка) SARS-CoV-2.

Заведующий отделом зоонозных инфекций и гриппа ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Александр Рыжиков сказал на встрече с инициативной группой участников КИ, что этот выбор был обусловлен высокой стоимостью гемоцианина, и кроме того, N-белок — «бесценный источник большого количества Т-хелперных эпитопов коронавируса». В то же время не исключено, что замена носителя привела к более низким титрам антител у людей по сравнению с теми титрами, что были получены в экспериментах на животных (действительно очень высокими).

«Я не вижу мягкого выхода из сложившейся ситуации»

О защитной эффективности, то есть влиянии вакцины на вероятность заболеть COVID-19, количественных данных пока нет. Фаза 1-2 КИ была начата в июле 2020 года и завершится 18 мая 2021 года, тогда, очевидно, будут окончательные данные о доле заболевших среди вакцинированных и среди получивших плацебо. В статье сообщается об одном вакцинированном, заболевшем COVID-19, и одном в группе плацебо. Однако 100 человек, из которых 43 получили плацебо, а остальные вакцину, — это в любом случае мало для достоверной статистики. Промежуточный ответ по пострегистрационным испытаниям, в которых принимают участие 3000 человек, будет подготовлен не позднее середины апреля, заявил Владимир Петров, заведующий информационно-аналитическим отделом ГНЦ ВиБ «Вектор».

Иммунный ответ на вакцину «ЭпиВакКорона», то есть появление антител и клеточного ответа у вакцинированных, обсуждается с начала года. В январе пресс-служба Роспотребнадзора сообщила, что «по результатам 1-2 фаз клинических испытаний иммунологическая эффективность вакцины «ЭпиВакКорона» составляет 100%». Подчеркивалось, что выявлять иммунный ответ нужно с помощью специального теста, в котором антитела взаимодействуют не с полноразмерным S-белком коронавируса, как в большинстве коммерческих тестов, а с пептидами, подобными тем, что входят в состав вакцины. Это вызвало новый вопрос: если так, то будут ли антитела, возникшие после прививки «ЭпиВакКороной», взаимодействовать c S-белком реального вируса?

Участники КИ, разочарованные отсутствием информации, начали проводить собственное исследование (epivakorona.com). Ранее на этой неделе они опубликовали открытое письмо, в котором говорилось, что среди вакцинированных есть заболевшие, в том числе госпитализированные, и что «120 участников III фазы клинических исследований и 19 вакцинированных в рамках гражданской вакцинации сдали анализ на антитела тест-системой, рекомендованной Роспотребнадзором. У 30% антитела обнаружены не были (для участников клинических исследований сделана поправка на плацебо)».

Более того: защитная эффективность в значительной мере определяется нейтрализующими антителами. В экспериментах, организованных инициативной группой, не удалось обнаружить нейтрализующей активности ни в одном из десятков образцов сыворотки вакцинированных. Реакцию нейтрализации проводили в нескольких лабораториях. На сайте epivakorona.com подробно описаны результаты, которые получил д.б.н. Александр Чепурнов, ведущий научный сотрудник ФИЦ фундаментальной и трансляционной медицины СО РАН, ранее заведующий лабораторией особо опасных инфекций «Вектора». Александр Чепурнов имеет опыт работы с SARS-CoV-2 и часто дает комментарии для СМИ. Он также является автором научно-популярной книги «Вирусолог: цена ошибки» о вирусе Марбург.

А дальше самое интересное. Эти результаты прямо противоречат данным, представленным в статье. В первой фазе, напомним, участвовало 14 человек, во второй — 86, но половина получила плацебо. Из 57 вакцинированных антитела появились у всех. И не только к антигенам вакцины, но и к полноразмерному вирусу SARS-CoV-2, инактивированному бета-пропиолактоном. Нейтрализующая активность также наблюдалась у всех вакцинированных, разброс титров от 1:20 до 1:160. В публикации разработчиков подробно описан метод определения титров нейтрализующих антител: в текст включены мелкие детали, которые обычно помещают в приложения, вплоть до числа промываний лунок с клетками.

Как такое могло произойти? Хорошо известно, что абсолютные значения нейтрализующих титров, полученных в разных лабораториях, сравнивать трудно. Различаются условия реакции нейтрализации, методы детекции поражения клеток, сами критерии «нейтрализующего титра»: например, нейтрализующим может называться максимальное разведение сыворотки крови человека, при котором вирус не сможет заразить клетки в культуре, или такое разведение, при котором число инфицированных клеток уменьшится вдвое. Но различие между «антитела есть у всех» и «нет ни у кого» слишком велико для методических нюансов.

На вопрос отвечает Андрей Криницкий, генеральный директор компании eland.ru и основатель проекта epivakorona.com.

«Есть случаи, в которых конкретная технология роли не играет. В данной ситуации либо кто-то совершил ошибку (многократную) при эксперименте, либо врет.

Александр Чепурнов ошибку совершить не мог, так как в эксперименте есть "контроли" (образцы от вакцинированных Спутником V либо переболевших, причем исследователи не знали, какие образцы кому принадлежат. — PCR.NEWS). Эксперимент повторяли многократно в той же лаборатории. И такие же точно данные были получены в двух других независимых лабораториях. С учетом большого резонанса и общественной важности мы на всякий случай повторим эксперимент Чепурнова еще раз, уже в Москве. Это будет уже пятая такая проверка и вторая по нашей инициативе.

Я не вижу красивого и мягкого выхода из сложившейся ситуации — у двух сторон диаметрально противоположный результат эксперимента. Значит, точно как минимум у одной из двух сторон все очень плохо. Пока мы не найдем лабораторию, которая осмелится открыто и официально опубликовать результаты такого эксперимента, я могу лишь просить влиятельных лиц точно так же, как мы, в частном порядке заказывать повтор эксперимента и действовать, исходя из его результатов. Не нужно верить на слово "Вектору", не нужно верить нам — повторите и посмотрите сами. Вопрос жизни и смерти многих людей, оно того правда стоит».

В заключительной части статьи разработчиков вакцины говорится, что «высокие титры вирус-специфических антител не обязательно ассоциированы с защитой от COVID-19». Авторы отмечают, что N-белок в составе вакцины, хотя и не бывает мишенью нейтрализующих антител, в отличие от S-белка, но может способствовать появлению вирус-специфических Т- и В-клеток памяти, причем Т-клетки памяти могут сохраняться дольше В-клеток. Надо понимать, однако, что пептидная вакцина, в отличие от вакцины на основе аденовируса или мРНК, не может способствовать выработке цитотоксических Т-клеток (Т-киллеров, CD8+ Т-лимфоцитов), то есть речь идет только о Т-хелперах (CD4+), и прежде всего о тех, что активируют B-лимфоциты, производящие антитела.

К сожалению, об исследовании Т-клеточного ответа в статье ничего не сказано.

Об эпитопах и антителах

Важные технические подробности мы попросили прокомментировать Кирилла Скрипкина. Кирилл — врач-биофизик, он внимательно отслеживает информацию, связанную с «ЭпиВакКороной», и его комментарии в соцсетях неизменно содержательны.

Кирилл, первый вопрос — о пептидах, которые использовались в вакцине. Среди моих знакомых вы первым нашли патент, где были названы эти участки: S454-477, S1179-1200, S1189-1209. То есть один пептид из рецепторсвязывающего домена RBD субъединицы S1 и два перекрывающихся — из субъединицы S2. Эти пептиды включают описанные в других работах эпитопы, участки, с которыми могут связываться нейтрализующие антитела, например S454-463 или S456-460. Это означает, что образование нейтрализующих антител к вакцине возможно?

У критиков этой вакцины есть разумное возражение, что эпитопы, описанные в статьях по ссылкам выше, относятся не к линейным эпитопам, а к конформационным. Следовательно, линейная аминокислотная последовательность из этого эпитопа в вакцинном пептиде не может вызвать образование нейтрализующих антител. Но авторы первой работы заявляют, что они картировали именно линейные эпитопы. Кроме того, по словам тех же авторов, антитела к конформационным эпитопам могут сохранять некоторую аффинность к линейным пептидам, составляющим эпитоп.

Другие два пептида: насколько можно понять из заявлений для широкой публики про «три линии защиты», антитела к ним должны помешать слиянию вируса с клеткой, поскольку субъединица S2 отвечает за слияние. Это эффективно? Другие разработчики вакцин так делали? Ваше мнение, для чего выбрали перекрывающиеся пептиды?

Для ответа на первый вопрос нужно понять, что имеется в виду по словом «эффективно»? Efficacy, effectiveness или efficiency? (То есть снижение заболеваемости в вакцинированной группе людей по сравнению с невакцинированной в «идеальных» контролируемых условиях, например, в клинических исследованиях; то же в реальных условиях; или соотношение затрат и результата. — PCR.NEWS.) Если efficacy, то по промежуточным результатам фазы 1-2 КИ можно сказать, что пока да, но нужно дождаться результатов третьей фазы. Об effectiveness можно будет узнать только из результатов гражданской вакцинации, если их раскроет Роспотребнадзор, а efficiency должен оценить планово-экономический отдел Минздрава.

По второму вопросу: разработчики пептидной вакцины COVAXX — UB-612 из Тайваня также использовали пептиды из S2 субъединицы и N-белка в своей вакцине.

По третьему вопросу: я всегда верю в лучшее, поэтому считаю, что использование двух перекрывающихся пептидов с сайтом гликозилирования в них — это какой-то хитрый план. Хотя в новом патенте от Вектора остался только один пептид из S2 субъединицы: S1179-1209.

Авторы пишут, что выбрали пептиды, а не полноразмерный S-белок, потому что опасались антителозависимого усиления инфекции. С другой стороны, в качестве носителя был выбран N-белок. А использование полноразмерного N-белка в качестве носителя пептидов не может привести к АЗУИ? И кстати, АЗУИ при инфекции SARS-CoV-2 вообще зарегистрировано?

Благодаря уважаемой Ольге Матвеевой мы знаем, что N-белок первого SARS вызывал ассоциированное с вакциной усиление инфекции у мышей (статьи 2008 и 2010 гг.). Достоверной информации о регистрации АЗУИ при инфекции SARS-CoV-2 на данный момент нет.

Иммуногенность определяли тремя способами: антитела к пептидам в составе вакцины, антитела к инактивированному вирусу SARS-CoV-2 и антитела, нейтрализующие жизнеспособный SARS-CoV-2. Отвечают ли эти эксперименты на вопрос, будут ли антитела, вызванные вакциной, взаимодействовать с реальным вирусом?

Да, в эксперименте по нейтрализации была показана способность вакцинных антител препятствовать проникновению жизнеспособного вируса SARS-CoV-2 в клетки Vero E6, которые несут на свей поверхности молекулы ACE2.

Сравнивать разные эксперименты по установлению нейтрализующей активности сложно, но давайте попытаемся. В фазе 3 клинических испытаний «Гам-Ковид-Вак» у 100 человек среднегеометрический титр нейтрализующих антител на 42-й день был равным 44,5, антитела у всех, кроме троих. В публикации «ЭпиВакКороны» — титры нейтрализующих антител после двух вакцинаций от 20 до 160, среднегеометрический титр 68 на 35-й день, сероконверсия у 100%. Методы и определение «титра нейтрализации» в этих работах различаются. Но хотя бы примерно, у кого титры больше?

Нет, сравнивать между собой результаты двух абсолютно разных методов нейтрализации совершенно неправильно. Соотносить друг с другом можно только результаты сравнения нейтрализующих титров антител у вакцинированных и рековалесцентов для обоих типов реакции нейтрализации. В Гамалеи такое сравнение провели, а вот в «Векторе» почему-то нет.

В то же время авторы подчеркивают, что защита от COVID-19 возможна и при низких титрах. Также они отмечают, что в экспериментах на приматах нейтрализующие антитела появились, но исчезли за четыре недели до эксперимента по заражению обезьян вирусом, однако защитная эффективность была продемонстрирована. Говорится, что N-белок был выбран, поскольку в нем содержатся эпитопы клеточного иммунитета. Но при этом данных по клеточному иммунному ответу у участников КИ в статье нет. Что можно сказать по клеточному иммунитету, вызванному пептидной вакциной?

Как только исчезают плазматические клетки, которые нарабатывают нейтрализующие антитела, исчезают и сами эти антитела. Среднее время полужизни иммуноглобулинов G составляет 21 день. То есть нейтрализующие антитела у приматов были вновь наработаны клетками иммунологической памяти. Это можно было бы подтвердить, если бы у приматов определялся титр нейтрализующих антител после нагрузочного испытания, но авторы статьи об этом умалчивают. О клеточном иммунитете есть заявление уважаемого Александра Рыжикова: «Что касается клеточного иммунного ответа, он присутствует и сдвинут, как мы наблюдали на приматах также и у людей, в так называемый Th2-тип иммунного ответа, то есть гуморальный иммунитет доминирует. И клетки CD8 (цитотоксические лимфоциты) слабо индуцируются этим типом вакцин».

 

PCR.news наблюдает за развитием событий. Очевидно, в скором времени у нас будет больше информации.

 

 

Источник

А.Б.Рыжиков и соавт. // Простое слепое плацебо-контролируемое рандомизированное исследование безопасности, реактогенности и иммуногенности вакцины «ЭпиВакКорона» для профилактики COVID-19 на добровольцах в возрасте 18–60 лет (фаза I–II). // Инфекция и иммунитет. 2021, 11, 2; DOI: 10.15789/2220-7619-ASB-1699

Добавить в избранное

Вам будет интересно