Магнитные частицы: структура, возможности, разработка

Множество научных и диагностических лабораторий используют магнитные частицы для выделения нуклеиновых кислот и других биомолекул. Сегодня мы отвечаем на самые распространенные вопросы об этом виде сорбентов и беседуем с российским разработчиком — Валентином Натаровым из компании «Гентерра».

Credit:
Гентерра

Разбираемся, какие бывают магнитные частицы, что влияет на фрагментацию ДНК при выделении, какие биомолекулы можно выделять с помощью магнитных частиц, кроме нуклеиновых кислот, и как были разработаны отечественные магнитные сорбенты.

 

Семь вопросов о магнитных частицах

Для выделения ДНК достаточно добавить в образец магнитные частицы?

Недостаточно. Однако коммерческий набор для экстракции — это готовое решение. В набор, кроме магнитных частиц, обычно входят реагенты для лизиса клеток, для сорбции нуклеиновых кислот на поверхности частицы, для отмывки примесей и, наконец, буфер для элюции, который снимает ДНК с поверхности частиц.

Как устроены магнитные частицы, из чего они состоят?

За связывание биомолекул отвечает функциональный компонент в составе композитной частицы, который может сорбировать нуклеиновые кислоты, белки, низкомолекулярные соединения или даже целые клетки. Основной механизм сорбции и десорбции биомолекул на частицах — электростатический, поэтому важно понимать, какой заряд несут интересующие биомолекулы при различных значениях рН в растворе. А магнитный компонент отвечает за последующее выделение частиц. При наведении внешнего магнитного поля, например, с помощью постоянного магнита, частицы притягиваются к нему, их можно отмыть и затем элюировать интересующие вещества с их поверхности.

Структуры магнитных частиц могут быть различными. Классический вариант — «оболочка-ядро»: парамагнитное ядро, например, из оксида железа, которое равномерно покрыто функциональной оболочкой — если речь идет о выделении нуклеиновых кислот, это может быть диоксид кремния или модифицированный полимер. Но в последнее время встречается много различных вариаций структуры магнитных композитов: например, пленка функционального сорбента покрывает немагнитное ядро, используемое в качестве матрицы. Магнитный материал в ядре может быть представлен как единой большой гранулой, так и мелкими наночастицами магнетита, распределенными в матрице.

Магнитные частицы можно использовать только со специальным планшетом?

Никто не запрещает осаждать магнитные частицы без магнитного штатива, с помощью центрифуги, в этом их универсальность. Но в роторе центрифуги обычно всего 12 или 24 посадочных места для пробирок объемом 1,5 мл. А магнитный штатив — это обыкновенный пластиковый штатив для пробирок, в стенки которого встроены маленькие, но очень мощные магниты из неодимового сплава. Магниты собирают частицы из объема раствора к стенке пробирки.

Credit: Гентерра 

Штативы могут быть как на 12, так и на 48 и 96 пробирок, что увеличивает скорость работы за счет параллельного выделения из многих образцов. Бывают магнитные штативы для пробирок разных объемов, от 0,2 мл до 50 мл. Стоимость такого штатива — порядка нескольких тысяч рублей.

Экстракция с помощью магнитных частиц чаще используется в научных лабораториях или в клинико-диагностических?

И в тех, и в других. Однако ученые обычно предъявляют более высокие требования к чистоте и качеству выделяемой ДНК: минимальное количество примесей, минимальная степень деструкции нуклеиновых кислот. Сейчас очень популярны исследования транскриптомов, поэтому также востребовано выделение РНК. В клинико-диагностических лабораториях требования менее жесткие, потому что производители наборов учитывают остаточное количество примесей при разработке тест-систем и оптимизируют свои наборы под это.

При выборе магнитных частиц нужно исходить из поставленных задач. С каким биоматериалом приходится работать — это могут быть бактериальные клетки, кровь, плазма, буккальный эпителий, другие клинические или природные образцы. Что именно нужно выделить: плазмидную ДНК, геномную или вообще не ДНК, а другие биомолекулы, и для чего очищенный биоматериал понадобится в дальнейшем.

Кроме того, важно оценить объем работ. В научной лаборатории обычно ставят не более сотни выделений за день, а в клинико-диагностической лаборатории счет идет на десятки тысяч. При большой загрузке стоит задуматься о приобретении роботизированной станции для работы с магнитными частицами. Только такое решение позволило клинико-диагностическим лабораториям по всей стране справиться с многократно возросшим объемом исследований во время пандемии коронавируса.

 Credit: Гентерра


Правда ли, что выделение ДНК при помощи магнитных частиц приводит к ее фрагментации?

Молекула ДНК длинная и тонкая, поэтому ее фрагментация при выделении происходит всегда. Здесь важна не природа частиц или реагентов, а механические нагрузки. Необходимо адаптировать любые протоколы — избегать интенсивного перемешивания, центрифугирования на высоких оборотах. Даже резкость отбора образца автоматической пипеткой влияет на фрагментацию геномной ДНК. Поэтому важно не то, какие частицы использовать, а как именно выделять ДНК. Но это требуется только в очень специфических исследованиях — для большинства применений стандартные протоколы обеспечивают отличные результаты.

Какие биомолекулы, кроме нуклеиновых кислот, можно выделять с помощью магнитных частиц?

Спектр применения магнитных частиц очень широк. С их помощью можно выделять белки, в том числе антитела, хотя это более сложные объекты, чем нуклеиновые кислоты. Например, их можно использовать для иммунопреципитации или выделения белка, несущего особый таг. Можно концентрировать малые молекулы — пестициды и микотоксины. Также возможно выделение целых клеток — на этом построена магнитная сепарация иммунных клеток. При необходимости производитель может модифицировать частицы под требования заказчика, например, добавить особые функциональные группы для иммобилизации биомолекул, варьировать пористость поверхности, форму пор, количество гидроксильных групп, размер частиц.

Если сравнить выделение на магнитных частицах с другими методами экстракции нуклеиновых кислот, в чем его преимущества и недостатки?

Существуют сорбентные и бессорбентные методы выделения нуклеиновых кислот. Основное преимущество сорбентных методов — скорость и простота очистки. Бессорбентные методы — это, например, классическая экстракция смесью фенол-хлороформ, которую до сих пор используют многие научные лаборатории. Она позволяет получить концентрированный продукт с высокой степенью очистки от примесей. Однако большое количество манипуляций увеличивает длительность процедуры и вероятность загрязнения, а использование сильно пахнущих летучих токсичных веществ требует дополнительных мер предосторожности. Методы термокоагуляционной экстракции фактически сводятся к лизису образца и осаждению примесей; они быстрые, но не могут обеспечить высокой чистоты образца и применимы только для выделения бактериальной ДНК из мочи.

Сорбентные методы — это очистка на немагнитных и магнитных частицах в различных форматах. Преимущество магнитных сорбентов очевидно: для очистки не нужны высокоскоростные центрифуги. Так, классические частицы диоксида кремния осаждаются, как правило, при оборотах свыше 6000 rpm, а это уже довольно дорогая среднескоростная центрифуга, и она позволяет выделять лишь 12–24 образца. Еще более важный плюс магнитных частиц — возможность использования роботизированных станций для выделения и очистки нуклеиновых кислот. Методы с колонками и немагнитными сорбентами требуют обязательной стадии центрифугирования, и это очень затрудняет роботизацию.

Роботизированные системы выделения нуклеиновых кислот на основе магнитных частиц активно развиваются. И если раньше на рынке была только относительно дорогие инструменты, например KingFisher производства ThermoFisher или продукция Hamilton, то сейчас на рынке появляются более доступные роботизированные системы для работы с магнитными частицами, которые заметно повышают популярность этого метода и вытесняют наборы для немагнитных сорбентов и микроцентрифужные колонки.

«Это универсальный сорбент, востребованный на российском рынке»

Подготовить ответы на вопросы PCR.news помог Валентин Натаров, ведущий технолог участка магнитных сорбентов компании «Гентерра». Валентин руководил разработкой магнитных частиц, которые «Гентерра» вывела на рынок.

IMG_3895 (1).JPG Валентин Натаров. Credit: Гентерра

Валентин, расскажите, пожалуйста, какие магнитные частицы производит Гентерра?

Наш основной продукт — магнитные частицы ExtraGen. Это универсальная «рабочая лошадка»: параметры, которые были заданы при их разработке, подходят под широкий спектр задач, связанных с очисткой нуклеиновых кислот из наиболее часто исследуемых биоматериалов — из крови, мочи, фекалий, слюны, лаважных смывов. Частицы совместимы с широким спектром реагентов, используемых при лизисе и отмывке, они толерантны к спирту, ацетону, концентрированным солям. Они уже протестированы нашими основными клиентами, ведущими российскими производителями наборов для выделения нуклеиновых кислот. Мы также проводим исследования по разработке новых типов частиц и модификации существующих частиц под требования заказчика.

Помимо простого выделения нуклеиновых кислот из клинических и природных образцов, нас интересуют более специфические задачи. Например, очистка продуктов ПЦР. При клонировании ДНК необходимым этапом является проведение ПЦР, и продукт амплификации нужно очистить: выделить фрагмент ДНК, отделить его от дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и компонентов буфера. Это также можно сделать с магнитными частицами, но укомплектованными другим, специальным буфером. Мы говорим сейчас о частицах SPRI, это тоже наша собственная разработка. В отличие от магнитных частиц ExtraGen, которые представляют собой просто сырые магнитные частицы в транспортной среде, частицы SPRI — уже готовое решение со специальным буферным раствором для очистки ампликонов, коротких двуцепочечных ДНК и размерно-селективного выделения нуклеиновых кислот. Сейчас эта область стала особенно популярной в связи с тем, что активно развиваются методы геномного секвенирования нового поколения, и на одном из этапов пробоподготовки необходимо выделить фракцию двухцепочечной ДНК определенной длины — чаще всего 150–500 пар нуклеотидов.

Также у нас есть ExtraGen Amino и ExtraGen Carboxyl. Это магнитные частицы ExtraGen, но с модифицированной поверхностью, несущей аминогруппы и карбоксильные группы. Их, в свою очередь, можно модифицировать антителами или белками, например, по реакции NHS-присоединения. Кроме того, мы разрабатываем другие типы частиц с активными функциональными группами, например, функциональные частицы для еще одной популярной области — клик-химии.

Отдельно стоит упомянуть частицы PolyMag, которые имеют ядро из полистирола. Он используется в качестве матрицы, на которой происходит конструирование частицы. Таким путем удается получить магнитные частицы с очень узким распределением по размеру. Мы думаем, что эти частицы будут более перспективны для сложных задач — выделения белков, антител, клеток.

Как начиналась история разработки магнитных частиц в Гентерре?

Разработка началась пять лет назад. Я тогда руководил процессом. Разработки шли два года, постепенно, от стадии лабораторного синтеза в малом объеме. Начали мы с изучения размерных и физико-химических характеристик имеющихся на рынке продуктов. Потом стали делать первые эксперименты по лабораторному синтезу частиц, оптимизации их параметров, в плане размеров, химии поверхности. Конечно, принимали во внимание, что в дальнейшем планируется масштабное производство, учитывали и стоимость реагентов и материалов, и трудозатратность процесса. Мы сотрудничали с некоторыми нашими заказчиками и диагностическими лабораториями, где проводили эксперименты по исследованию свойств частиц. Продажи ExtraGen как готового продукта начались в 2018 году.

Постепенно производители стали внедрять магнитные частицы Гентерры в свои диагностические наборы. Процесс этот был весьма небыстрым, как и любой переход научной разработки в производство. Нужно еще иметь в виду, что мы в первую очередь нацелены на рынок клинико-диагностических лабораторий, соответственно, набор на магнитных частицах является изделием медицинского назначения и не может применяться в диагностических лабораториях до его регистрации. Но уже когда наши партнеры зарегистрировали наборы, началась более активная работа.

Конечно, пандемия коронавируса катализировала увеличение объемов производства. У нас появилась отдельная лаборатория по магнитным частицам, начали нанимать новых сотрудников на этот участок. Кроме этого, благодаря упрощенной процедуре регистрации наборов стремительно появились новые партнеры. Долгий путь прошли наши частицы, и сейчас уже можно сказать, что это универсальный сорбент, востребованный на российском рынке. Производятся они в больших количествах, особенно относительно того, что было раньше или вообще что планировалось. И, я надеюсь, что нашими усилиями мы смогли как-то помочь в решении задач, появившихся из-за пандемии.

Какие еще разработки ведутся в вашем отделе?

В целом мы планируем расширение линейки магнитных частиц, чтобы охватить больший рынок. В данный момент мы нацелены на то, чтобы разработать отечественные аналоги зарубежных сорбентов для очистки биомолекул — нуклеиновых кислот, белков, клеток и т.п. — и наладить их серийное производство. Кроме того, у нас проводятся разработки иных реагентов, например полимерных микросфер, окрашенных соосадителей нуклеиновых кислот, готовых буферных растворов, которые могут быть востребованы в молекулярной биологии и медицинской диагностики. Поскольку мы не только производители, но и разработчики, у нас есть оборудование, ресурсы и опыт для того, чтобы сделать магнитные частицы с теми характеристиками, которые интересуют наших клиентов. Мы всегда рады сотрудничеству с производителями диагностических наборов и при необходимости готовы произвести разработку и наладить выпуск интересующего их продукта.

 

Партнерский материал



Узнать подробности о продукции АО «Гентерра»:

+7 495 7212970

+7 929 6925864

info@genterra.ru

 

Добавить в избранное

Вам будет интересно