Нариман и его мыши

В Новосибирске работают над созданием линий мышей, восприимчивых к коронавирусу. В прошлый вторник родились первые, вероятно, трансгенные мышата. Мы поговорили с руководителем лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН и руководителем проекта Нариманом Баттулиным.

Нариман Баттулин и Алексей Кораблев.

Когда у вас возникла идея о создании линии и понимание, что есть для этого возможности?

В воскресенье вечером 29 марта пришло письмо от заведующего отделом молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ГНЦ ВБ «Вектор» Валерия Борисовича Локтева с вопросом, можем ли мы достать или создать мышей, восприимчивых к коронавирусу. В понедельник мы встретились в лаборатории с руководителем нашего отдела Олегом Леонидовичем Серовым и нашим главным специалистом по трансгенным мышам – м.н.с. Алексеем Кораблевым и обсудили, кто что успел за ночь начитать по теме. На следующий день в Новосибирске объявили обязательную самоизоляцию и потянулись рабочие карантинные будни. К тому моменту уже было ясно, что вирус проникает в клетки через ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2), и что это тот же рецептор, который был у SARS-CoV. И четыре мышиные модели, которые были для него разработаны, для нового вируса тоже подходят. В геном этих мышей вставили человеческий ACE2 (hACE2) под разные промоторы.

То есть можно просто заказать этих мышей?

Для заказа доступна только одна линия в Jackson Laboratory. В начале пандемии эти мыши были в состоянии замороженных сперматозоидов, а поставки не начнутся раньше, чем в конце июня. В начале марта у них уже было заказано более 3000 животных, мы в этой очереди были бы далеко не первыми. Покупка животных из-за рубежа всегда проблемна, а тут еще карантинные меры — это будет долго и сложно. В этом случае проще сделать самим.

Расскажите подробнее про технологии.

Мы решили делать параллельно три варианта, у каждого плюсы и минусы. Какая модель лучше, до экспериментов сказать не можем.

В первой модели в составе транспозона мы вносим hACE2 под контролем конститутивного человеческого промотора, который будет работать во всех клетках и тканях. Мы боялись, что такая повсеместная экспрессия может навредить здоровью животных. Но нашли статью, в которой тоже использовался конститутивный промотор, и такие животные были здоровы. Транспозон состоит из hACE2, промотора и терминатора транскрипции, по краям — инвертированные повторы. Вместе с ДНК в зиготу мы вводим мРНК транспозазы, которая транслируется. После этого фермент узнает последовательности на транспозоне и интегрирует его в геном в конкретное место в одной копии. Этот вариант хорош тем, что генетические конструкции очень простые, ожидаемая эффективность высокая — около 50% потомства, стабильная экспрессия и быстрая реализация.

Во второй модели используем knock-in: hACE2 вставляем под контроль мышиного промотора ACE2. Ожидается, что этот ген будет работать там же, где и мышиный. Собственный мышиный ген выключаем с помощью CRISPR. В статье китайских авторов, которая вышла в конце мая, этот вариант реализован один в один. Сложность в том, что конструкции достаточно большие, и нужно ген в конкретное место генома вводить. Сейчас мы застряли из-за того, что все фирмы, которые синтезируют олиги на заказ, заняты производством тестов для коронавируса. Но мы надеемся до конца августа всё-таки этих животных получить.

Наш самый любимый — третий, наиболее адекватный вариант: гуманизация участка на поверхности ACE2, связывающего вирус. Для этого нужно поменять буквально несколько аминокислот. Плюс в том, что в остальном сохраняется мышиный белок: он с другими белками, протеазами, будет взаимодействовать как родной. Мы минимально вмешиваемся в регуляцию гена и в белок-белковые взаимодействия, которые есть в организме. Но эта модель самая сложная: то, что в пространстве на белке в одном месте находится, в линейном гене раскинуто на три разных экзона.

И участки надо все поменять?

Неизвестно заранее, но по-хорошему да. Либо последовательно, либо одновременно. Это еще никто не делал. Если удастся модифицировать все три участка одновременно, мы получим таких животных до осени, если придется делать последовательно, то в феврале-марте следующего года.

В первой модели у животных остается родной рецептор, во второй — только человеческий. Какая модель лучше с точки зрения эффективности инфицирования вирусом?

Второй вариант лучше для мышей, потому что они погибать не будут. Мыши с транспозоном при заражении будут сильнее страдать, так как из-за конститутивного промотора рецептор экспрессируется в большем количестве типов клеток. Это плохое воспроизведение человеческой болезни.

Как будет детектироваться экспрессия рецептора?

Наш белок несет тег для специального антитела. Мы решили не использовать флуоресцентные белки, как в майской статье. Это не очень удобно с точки зрения визуализации, но, возможно, чуть лучше для сохранения регуляции.

Есть ли у вашей модели еще какие-то отличия от той, что в статье? Кроме экспрессии флуоресцентных белков.

У нас меньше генетические конструкции и мы лучше терминируем транскрипцию: после человеческого гена мы добавили три сайта терминации. Это нужно для того, чтобы не создавался химерный транскрипт — человеческих и мышиных экзонов. Человеческие экзоны заканчиваются стоп-кодоном, а в химерной мРНК стоп-кодоны могут оказаться не в конце. Клетка с помощью нонсенс-опосредованного распада мРНК уничтожает транскрипты со стоп-кодонами в неправильных местах. Таким образом, мы надежно терминируем транскрипцию, чтобы не потерять уровень экспрессии.

Какие есть недостатки у моделей?

Насколько я понимаю, есть глобальный недостаток, что это мышь, а не человек. Потому что физические размеры другие, просвет дыхательных путей совсем иной. Но это не всегда важно. Любая модель, которая заражается, хороша для тестирования вакцины: либо есть иммуногенные свойства, либо нет. Если детально исследовать именно механизмы течения заболевания, тут возникают тонкости.

Куда ваши трансгенные мыши поедут? Какие эксперименты с ними будут проводить?

Сначала их надо генотипировать. Потом они отправятся в «Вектор» здесь в Новосибирске. И их будут заражать коронавирусом: задача-минимум — показать, что линии к нему восприимчивы. После заражения — следить за их здоровьем, за потерей веса, потом гистологический анализ на количество РНК вируса в тканях. Дальше уже по ситуации.

Обсудим майскую статью. Получены ли на тех мышах какие-то результаты?

Вроде бы нет, они впервые описаны.

На что в статье вы обратили внимание?

В работе сравнивали восприимчивость к SARS-CoV-2 молодых и старых мышей — 7,5 месяцев. Статья поступила в редакцию в середине апреля, значит, если они выполнили все эксперименты прямо перед отправкой статьи, родиться мыши должны были в сентябре-октябре! Скорее всего, они делали этих мышей для старого SARS-CoV.

Но у вирусов же разная аффинность к рецептору?

Любая подобная модель подходит для обоих вирусов, каких-то принципиальных различий нет. Но мыши могут по-разному болеть.

В чем же подвох в статье?

В ней вообще не написано, для чего они делали этих животных. Это интуитивно понятно, но напрямую нигде не сказано, что для SARS-CoV. В пресс-релизах, где не соблюдают строго логику изложения, писали, что китайцы сделали животных для моделирования инфекции SARS-CoV-2. Если бы я писал эту статью, я бы просто указал, что у нас были мыши для первого SARS-CoV, и мы используем их для второго. Возможно, это связано с китайской политикой публикаций, сама статья очень долго выходила, хотя ковидные работы сейчас со свистом вылетают. Обидно, ведь их модель очень хорошая: она воспроизводит типичный паттерн экспрессии этого гена. Нет чтобы поделиться со всеми! Весь мир пытается получить крохи знаний сразу на людях, а у тебя при этом есть готовая мышиная модель.

Мыши генетически более однородны, чем люди. При этом есть данные, что варианты некоторых локусов связаны с тяжестью течения болезни. Можно ли на мышах смоделировать подобную генетическую разнородность?

На мышах это моделировать сложно. У нас есть мысль выключить ген GATA2 — ключевой транскрипционный фактор, который запускает ответ IFN-1. Такие мыши с нокаутом будут давать ответ на вопрос, насколько эта реакция важна: будет ли течение болезни более слабым или более сильным. Но на это уйдут не месяцы, скорее — годы.

Есть модель, где hACE2 экспрессируют только в дыхательных путях. У вас были мысли сделать что-то подобное?

Это был один из вариантов, когда мы думали, как мы будем этих мышей делать. Вводить аденовирусный вектор с геном рецептора ингаляционно. Это хороший способ получить много животных разного возраста. Но у нас нет такого опыта, поэтому мы не стали бросаться. И в России никто таких мышей не делает.

Кроме отсутствия олигов, у вас есть еще какие-то сложности при создании мышей?

Самая очевидная — проблема финансирования. Нет фондов, которые могли бы быстро реагировать на такие ситуации. Наша дирекция оплатила первые закупки, остальное — из собственных средств лаборатории. Мы написали заявку в РФФИ на конкурс проектов по исследованию коронавируса, очень надеемся, что она пройдет. Генетические конструкции сделать — порядка 100–150 тысяч, ферментов закупить — еще примерно столько же. Небольшие деньги, но они все равно нужны. Нужны регулярно, и это большая проблема.

Что бы вы хотели отметить в конце?

Хочется поблагодарить тех людей, которые приняли участие в этом проекте. Бориса Владимировича Скрябина из университета Мюнстера в Германии, который внес существенный вклад в дизайн нашего эксперимента. Директора института Алексея Владимировича Кочетова, коллег из соседних институтов, сотрудников нашего вивария. Я рад, что люди активно откликаются, когда что-то нужно, я могу прийти к директору и сказать: «Мы делаем коронавирусных мышей, мы занимаемся суперважной тематикой, нам нужна помощь». Сейчас все откликаются, это такой лайфхак. Или: «...ребята мы спасаем мир, делаем коронавирусных мышей. Вы нам олиги давайте, пожалуйста, побыстрее».
a73cff98-d381-4285-88f8-6dd98b37a742.jpg Трансгенные (вероятно) мышата с матерью.

Добавить в избранное

Вам будет интересно