Нобелевская неделя 2019. Грегг Семенца: «Есть корреляция между старением, активацией HIF1 и восстановлением кровотока»

Первооткрыватель белка HIF — фактора, индуцируемого гипоксией, рассказал три истории о важности этого белка.

История 1. Механизм адаптации к гипоксии

Последние три десятилетия ученые пытаются понять, как человеческий организм может адаптироваться к изменениям доступности кислорода. Такая адаптация — это критическое умение каждой клетки человеческого тела, потому что клетки должны получать кислород постоянно: каждая из 100 триллионов клеток в нашем теле нуждается в кислороде, чтобы производить энергию. Именно для этого кровь переносит кислород через кровеносные сосуды по всему телу. А факторы, индуцируемые гипоксией, обеспечивают баланс между требуемым и поставляемым кислородом.

Изначально, Грегг Семенца и его коллеги пытались понять, как контролируется образование эритроцитов. Было известно, что этот процесс происходит в костном мозге, однако гормон, который его контролирует, — эритропоэтин (ЭПО), синтезируется в почке. И было известно, что у людей с хронической болезнью почек был нарушен синтез ЭПО, что приводит к анемии. Но все еще не было известно, как регулируется синтез ЭПО. В частности, что позволяет клеткам в почках вырабатывать ЭПО в ответ на изменение концентрации кислорода.

Ученым удалось идентифицировать короткую последовательность из 33 п.н., которая обладает очень важным свойством: ее можно вставить перед другим геном, и тогда экспрессия этого гена будет индуцироваться гипоксией. Был идентифицирован и выделен белок, который связывается с этой последовательностью HRE (hypoxia response element) в условиях нехватки кислорода. Его назвали HIF (hypoxia inducible factor): HIF-1 и HIF-1/2. Оказалось, что это гетеродимер, состоящий из субъединиц HIFα и HIFβ. В условиях гипоксии эти субъединицы образуют гетеродимер, связываются с HRE и привлекают другие белки — коактиваторы, которые служат мостом между HIF и РНК-полимеразой.

Возник вопрос: каков же механизм регуляции уровня HIF при нормальных условиях и при нехватке кислорода? Оказалось, дело в посттрансляционных модификациях (о чем еще расскажут Питер Рэклифф и Билл Кейлин). В нормальный условиях пролины P564 и P402 в HIF-1α гидроксилированы (причем в реакции гидроксилирования участвует молекула кислорода). И в этом случае с HIF может связаться белок VHL, который служит сигналом к уничтожению связываемого белка. Поэтому когда кислород доступен, HIF разрушается. Однако в гипоксических условиях, когда уровень кислорода снижается, реакция гидроксилирования ингибируется, VHL не может связаться и в итоге HIF-1α быстро накапливается. Есть и другая важная посттрансляционная модификация: гидроксилирование аспарагина N803 в HIF-1α. Будучи гидроксилированным, этот остаток связывается с другим белком, который был идентифицирован и назван FIH1 (Factor inhibiting HIF). Этот белок ингибирует способность HIF-1α привлекать белок — коактиватор транскрипции CBP. Впоследствии было показано, что FIH1 способен гидроксилировать остаток аспарагина. То есть это гидроксилирование мешает взаимодействию с активаторами. Опять же, в условиях гипоксии это гидроксилирование не происходит, связыванию с коактиваторами ничего не мешает и транскрипция гена эритропоэтина активируется. Таким образом, эти кислород-опосредованные модификации регулируют активность HIF1, что обеспечивает прямую связь между изменением доступности кислорода и активности HIF1.

На данный момент известны уже более чем 4000 генов, которые регулируются подобным образом — связыванием HIF с последовательностью внутри гена и активацией экспрессии генов при снижении уровня кислорода.

Когда возникает гипоксия? Она может быть либо результатом увеличения потребления кислорода (из-за увеличения числа клеток — например, в опухоли), либо результатом ухудшения снабжения кислородом (например, при ишемической болезни сердца, когда кровоток к части сердечной мышцы нарушен). В любом случае будет активирован HIF1 и нижестоящие целевые гены. При этом активация гена EPO — это ответ на системную гипоксию. Ответ является системным, увеличение числа эритроцитов повлияет на все клетки тела. Однако в случае коронарной недостаточности лишена кислорода только небольшая область сердечной мышцы. И поэтому ответ является локальным. Например, будут синтезированы факторы роста эндотелия сосудов и других белков, которые обеспечат рост кровеносных сосудов для увеличения поставки кислорода к гипоксической ткани.

Но независимо от того, является ли гипоксия системной или локальной, отдельные клетки должны адаптировать свой метаболизм к изменениям кислорода. И действительно, классическая метаболическая адаптация к гипоксии — это переход от дыхания, в котором используется кислород, к гликолизу, который позволяет вырабатывать энергию в отсутствие кислорода. И именно это помогает клеткам пережить кислородное голодание.

История 2. Жизнь без HIF

Другим важным этапом было исследование на мышах. Удалось получить гомозиготных по нокауту HIF1 мышей, но эмбриогенез таких мышей прерывался на середине беременности. Были дефекты в развитии сердца, кровеносных сосудов и образовании эритроцитов. А значит, нормальное развитие всех трех компонентов кровеносной системы зависит от HIF1.

Поскольку эти эмбрионы не доживали даже до рождения, изучать на них последствия отсутствия HIF1 у взрослых животных не представлялось возможным. Но гетерозиготные мыши развивались нормально, не считая нарушенной реакции на гипоксию.

И есть еще одна интересная деталь. Оказалось, что помимо собственно HIF1α, в человеческом геноме есть еще несколько похожих белков. Они были названы HIF-2α и HIF-3α. Эти белки являются продуктами разных генов, но имеют схожие последовательности. Все белки активируются в условиях гипоксии с помощью вышеописанных механизмов. В то время как HIF-1α присутствует во всех клетках всех видов животных, HIF2α и HIF3α появились только в эволюции позвоночных и есть только в определенных клетках во время развития позвоночных.

Но что насчет людей? Были выявлены пациенты с слишком высоким числом эритроцитов. Эти пациенты были склонны к инсультам и другим тромбоэмболическим расстройствам. Несколько команд ученых попытались определить мутации, которые были ответственны за этот фенотип. Первые мутации были обнаружены в рецепторе ЭПО на клетках — предшественниках эритроцитов. Эта мутация делает рецептор гиперактивным, так что он стимулирует производство эритроцитов даже в отсутствие ЭПО. Вторая группа мутаций находится в гене VHL: изменение единственной аминокислоты влияет на способность связываться с HIF2α. В результате меньше половины HIF2α разрушается при любой концентрации кислорода, то есть увеличивается активность HIF, что приводит к увеличению числа эритроцитов. У третьей группы пациентов мутировали ферменты, гидроксилирующие пролины. Опять же, изменение одной аминокислоты в белке уменьшает ферментативную активность. И, наконец, были семьи, в которых мутации находились в самом гене HIF-2а. И снова изменилась только одна аминокислота, но это значительно усложнило гидроксилирование остатков.

Вывод: мутации почти на любом этапе этого пути приводят к болезни, что демонстрирует критическую роль этого физиологического процесса в организме человека. Удивительно и несколько иронично, что те белки, с которых все начиналось — ЭПО и HIF-1, на данный момент единственные, мутации в которых не вызывают заболеваний.

Если речь идет о заболеваниях, то нельзя не отметить, что HIF играет большую роль в борьбе организма с различными болезнями. В том числе и с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Здесь есть две принципиально разные ситуации. Если пережата большая коронарная артерия, это может привести к стенокардии или боли в груди, что в конечном итоге может вызвать инфаркт миокарда. Если же артериальная непроходимость возникает в большом кровеносном сосуде в конечности, это приводит к боли в ней и может в конечном итоге привести к состоянию, когда поступающей крови недостаточно для поддержания жизнеспособности ткани. И во многих случаях потребуется ампутация из-за развивающейся гангрены. В это довольно трудно поверить, но из-за этого каждый день ампутируют конечности тысячам пациентов.

Важной особенностью этого заболевания является то, что оно возрастное, то есть гораздо чаще развиваются у пожилых людей. Моделирование на мышах стало бы хорошим подспорьем в борьбе с такими болезнями. Семенца и его коллеги пережимали главную артерию мышей, снабжающую кровью одну из ног и неинвазивно наблюдали за кровотоком. Как и ожидалось, уровень кровотока значительно снижался после операции. Но со временем у молодых животных кровоток восстанавливался, причем чем моложе была мышь, тем лучше шло восстановление. У очень старых мышей кровоток восстанавливался очень слабо. Более того, во всех возрастных категориях у мышей с гетерозиготным нокаутом HIF1 кровоток восстанавливался хуже, чем у мышей дикого типа. Таким образом, варьируя всего два параметра: возраст мышей и генотип одного локуса, можно получить весь диапазон от почти полного восстановления кровотока до отсутствия восстановления. Что очень удобно для исследований.

У молодых мышей дикого типа никогда не приходилось ампутировать конечность. У восьмимесячных мышей в 40% случаев наблюдалась либо отмирание кожи и мягких тканей ниже лодыжки, либо потеря нескольких пальцев. У двадцатимесячных животных в примерно 15% случаев приходилось ампутировать ногу выше лодыжки. И в каждой возрастной категории гетерозиготные мыши имели более тяжелый фенотип, чем мыши дикого типа. Проверка уровня HIF1 дала закономерный результат: чем моложе была мышь, тем больше HIF1 у нее вырабатывалось после операции.

Это означало, что есть корреляция между старением, активацией HIF1 и восстановлением кровотока. И если одним из основных эффектов старения как раз является нарушение нормальной реакции на гипоксию, то обретает смысл заместительная терапия.

С этой целью ученые создали аденовирусный вектор, который кодировал модифицированную форму HIF1 с мутациями, которые сделали его стабильным. Такой HIF1 не разлагался в нормальных условиях. Далее этот аденовирус или же контрольный аденовирус закалывали в ногу, на которой проводили операцию. И у мышей с введенным стабильным HIF1 кровоток восстанавливался гораздо лучше, причем разница была тем заметнее, чем моложе была мышь: в старых мышах восстановление соответствовало таковому в более молодых мышах, которым не вводили вектор.

А это значит, что возрастные нарушения удалось преодолеть. Есть надежда, что удастся разработать заместительную терапию, которая позволит пациентам избежать ампутации конечности.

Еще один аргумент в пользу такого подхода заключается в том, что HIF1 не просто контролирует экспрессию фактора роста эндотелия сосудов, это мощный регулятор, который контролирует экспрессию целого ряда белков, которые производятся клетками в условиях гипоксии, секретируются в кровоток, а затем связываются с рецепторами на клетках эндотелия кровеносных сосудов, предшественниках этих клеток и целого ряда других клеток, которые как раз и обеспечивают улучшение кровотока и оксигенации. И, опять же, было обнаружено, что при старении экспрессия всех этих белков нарушается. А при введении аденовируса с HIF1 экспрессия всех этих генов увеличивается.

История 3. Темная сторона HIF

Эта темная сторона — рак. В опухоли часть клеток отмирает, поскольку они находятся слишком далеко от кровеносного сосуда. Оказалось, что клетки непосредственно вокруг областей некроза производят невероятно много HIF. Вероятно, эти клетки играют особенно важную роль в метастазировании рака, а также в устойчивости раковых опухолей к иммунной системе и лечению. Большинство химиотерапий нацелены на быстро делящиеся раковые клеток, которые присутствуют вокруг кровеносных сосудов, но нет никаких одобренных методов лечения, которые уничтожали бы эти гипоксические раковые клетки, синтезирующие очень много HIF1 и HIF2.

Можно предположить, что ингибирование HIF1 может быть использовано в терапии рака. Поэтому ученые выделили несколько препаратов, которые по-разному ингибируют HIF1. Первый такой препарат — acriflavin. Оказылось, что acriflavin может связываться с HIF-1α и HIF-2α и предотвращать их димеризацию с HIF-1β. Эксперимент на мышах показал, что у животных, получавших acriflavin, опухоли растут очень слабо, а также наблюдается заметное снижение экспрессии всех рассмотренных целевых генов HIF1 по сравнению с контролем. На срезах же видно, что кровеносные сосуды уменьшаются, а значит, нарушается рост опухоли.

Ученых особенно интересовал рак молочной железы. Некоторые его типы лечат только химиотерапией. Однако при таком лечении часто случаются рецидивы. Обнаружилось, что экспрессия HIF особенно высока в этих опухолях. Поэтому одну из таких опухолей ввели в молочную железу мыши. И проверили эффективность ингибитора HIF — на сей раз digoxin. Рост опухоли замедлился по сравнению с контролем, а метастазирование клеток значительно снизилось.

Будет ли эффект больше, если совместить ингибитор HIF с химиотерапией? Ученые проверили это, используя препарат Gemcitabine. Сам по себе он значительно замедляет рост опухоли, но как только лечение прекращается, рост опухоли возобновляется. Если же добавить и ингибитор HIF, опухоль может быть уничтожена.

Исследование экпрессии разных генов в стволовых клетках опухоли на разных этапах развития показало, что все гены, которые индуцируются гипоксией или химиотерапией и контролируются HIF, ведут различными путями к синтезу белка NANOG. Однако при лечении химиотерапией с ингибитором HIF, увеличения количества NANOG не происходит.

Наконец, ученые исследовали роль HIF в устойчивости опухолей к иммунной системе. Чтобы бороться с адаптивным иммунитетом, раковые клетки экспрессируют несколько белков. Один из них, белок PDL1, связывается с белком PD1 на Т-клетках и инактивирует или даже убивает их. Второй белок, CDE 73, имеет тот же эффект. Против врожденного иммунитета, который в основном угрожает раковым клеткам, раковые клетки экспрессируют белок CDE 47. Он блокирует способность макрофагов убивать раковую клетку. Экспрессия генов перечисленных белков блокируется при использовании ингибитора HIF в мышах.

Однако названные ингибиторы по разным причинам не подходят для лечения пациентов. А из всего вышеперечисленного следует, что разработка таких ингибиторов очень важна и перспективна. И в лаборатории Семенцы сейчас активно этим занимаются.

В заключении лекции Семенца поблагодарил всех тех людей, которым он обязан этими открытиями и столь успешной карьерой.

Посмотреть на PCR.news лекцию Питера Рэтклиффа

Посмотреть на PCR.news лекцию Уильяма Кейлина