Нобелевская неделя 2019. Уильям Кейлин: «Ты не можешь пережить эмбриогенез по типу млекопитающего, не обладая этим геном. По крайней мере, если ты мышь»

«Очень приятно объяснять, как потеря VHL ведет к дерегуляции поставок мРНК. Но остается вопрос: как белок VHL узнает, есть кислород, или нет, и надо ли ему разрушить HIF-alpha?» Лекция лауреата Нобелевской премии по физиологии или медицине 2019 года. Сольна, 07.12.2019.

Изображение:
Скриншот канала Нобелевского комитета.

"Самое важное — поблагодарить талантливых молодых людей, которые успели поработать в моей лаборатории за все эти годы, героев истории, которой я поделюсь сегодня с вами. Также я благодарен моему наставнику времен докторантуры, Дэвиду Ливингстону, который научил меня, как быть ученым. До встречи с ним я собирался стать практикующим врачом и был интерном в школе медицины Джонса Хопкинса. Председателем там был великолепный доктор Виктор Маккьюсик, он показал мне важность истории медицины и генетики человека", — начал свою речь ученый.

Болезнь Гиппеля-Линдау

В 1894 году вышла статья, в которой впервые упоминается болезнь Гиппеля-Линдау, обнаруженная у брата и сестры в виде редкой формы рака — ретинальной гемангиобластомы, опухоли сосудов сетчатки глаза.

Спустя десять лет шведский невропатолог Гиппель нашел другую семью с такими же опухолями, однако его коллега Линдау был тем, кто показал, что они — результат проявления системного заболевания, затрагивающего разные органы, и часто сопровождаются кистозными гемангиобластомами в ЦНС (мозжечке и спинном мозге), феохромацитомами, а также кистами в почках.

Болезнь Гиппеля-Линдау — результат мутации в гене опухолевого супрессора VHL, она поражает одного человека из тридцати пяти тысяч и проявляется в виде гемангиобластом в ЦНС и сетчатке, светлоклеточной карциномы почки (самый распространенный тип рака почки; последний является наиболее распространенной формой рака у жителей развитых стран), феохромацитомы и некоторых других типов рака.

У носителя этой болезни обычно есть два аллеля гена Vhl — мутантный от одного родителя и нормальный от другого, однако клетки со временем утрачивают нормальный аллель, и образуется опухоль.

В 1993 году было доказано предположение, основанное на том, что организмы с мутацией в гене Vhl предрасположены к образованию светлоклеточной карциномы почки. У пациентов с ненаследственной светлоклеточной карциномой почки ген Vhl также инактивирован.

"Первичный сиквенс клеток опухоли не подсказал, как этот ген сдерживает рак, но моя клиническая практика оказалась здесь весьма полезной. Я знал, например, что опухоли, образующиеся при болезни Гиппеля-Линдау, обладают множеством кровеносных сосудов, то есть высоко ангиогенны. Светлоклеточные карциномы почки также высоко ангиогенны. Также было известно, что эти опухоли вызывают избыток продукции клеток крови. В норме гематокритное число — объем клеток крови относительно общего объема крови — составляет примерно 40%, тогда как у пациентов с болезнью Гиппеля-Линдау эритроциты производятся в избытке, гематокритное число повышено.

Итак, Болезнь Гиппеля-Линдау и ассоциированные с ней опухоли связаны с ангиогенезом в области опухолей благодаря перепроизводству VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) и иногда с избыточным производством клеток крови, поскольку опухоли перепроизводят эритропоэтин (EPO). VEGF и EPO объединяет тот факт, что оба они индуцируются, когда ткань испытывает кислородное голодание. Значит, между белком VHL и чувствительностью к кислороду должно быть некое звено".

Эксперименты с белком VHL

Были поставлены нозерн-блоты РНК клеток, содержавшихся при нормальной концентрации кислорода и в условиях гипоксии. Клетки культуры Hep3b, обладающие нормальным Vhl, накапливали гипоксия-индуцируемые мРНК при низких концентрациях кислорода. Наоборот, VHL-отрицательная культура 786-0 накапливала эти мРНК вне зависимости от концентрации кислорода. Полученные результаты решили подтвердить с помощью трансфекции. Было создано три VHL-положительных клона, и каждый из них накапливал гипоксия-индуцируемые мРНК при недостатке кислорода. В отсутствие белка VHL синтез гипоксия-индуцируемых мРНК становится независимым от концентрации кислорода.

Параллельные эксперименты показали, что белок VHL стабильно связывается с белками ElonginC, ElonginB, Cul2. Аналогичный комплекс у дрожжей выполняет функции убиквитин-лигазы.

"Мы начали подозревать, что наш комплекс, по аналогии [с дрожжевым], тоже убиквитин-лигаза. Более того, когда мы вычислили структуру этого белка, оказалось, что есть две точки, в которых может произойти мутация, вызывающая болезнь Гиппеля-Линдау. Первая — альфа-домен белка VHL, который осуществляет связь белка с остальными частями комплекса, и вторая — бета-домен, обладающий чертами потенциального субстрат-связывающего домена".

Затем возник вопрос: что является субстратом? Еще до этого было известно, что многие гипоксия-индуцируемые мРНК находятся под контролем транскрипционного фактора HIF.

"К счастью для всех нас, примерно в то время группа Питера (Рэтклиффа) опубликовала эту важнейшую статью, в которой показано, что клетки с недостатком белка VHL по какой-то причине неспособны разлагать HIF-alpha в обогащенной кислородом среде. Воспользовавшись этой подсказкой, мы тут же показали, что VHL-комплекс, разумеется, является убиквитин-лигазой для HIF-alpha".

Этот комплекс связывается с HIF-alpha напрямую, через бета-домен. Но только если кислорода вокруг в достатке. Если уровень кислорода низкий, или же белок VHL мутировал, как в случае рака почек, HIF-alpha не убиквитинилируется и стимулирует накопления гипоксия-индуцируемых мРНК.

"Очень приятно объяснять, как потеря VHL ведет к дерегуляции поставок мРНК. Но остается вопрос: как белок VHL узнает, есть кислород или нет, и надо ли ему разрушить HIF-alpha?»

Поставили эксперимент с линией клеток ts20, обладающих геном Vhl дикого типа, но также имеющих термочувствительную мутацию в убиквитин-активирующем ферменте Е1. Это значит, что при определенной температуре полиубиквитинилирование останавливается, а белки, которые иначе были бы разрушены, накапливаются. Вестерн-блот РНК клеток этой культуры показал, что при определенной температуре мРНК HIF-alpha накапливается. Но по-настоящему информативным оказался другой эксперимент, когда фильтр инкубировался не с антителами против HIF1-alpha, а с рекомбинантным белком VHL, а затем выявлял связавшийся VHL антителами против него. Этот белок мог напрямую взаимодействовать с HIF1-alpha, скопившимся в клетках, только в присутствии 21% кислорода. При гипоксии VHL не узнает HIF1-alpha. Также становится понятно, что сигнал должен приходить именно на HIF1-alpha, но не на VHL.

Следующий информативный эксперимент заключался в том, чтобы выяснить, какой самый короткий участок полипептидной цепи HIF1-alpha способен связаться с VHL, с тем, чтобы потом закрепить 25-аминокислотный пептид с биотином на конце в агарозном геле и продолжить изучать связывание. В центре пептида оказалась последовательность аминокислот MLAPYIPM. Иммобилизованная в агарозе и предварительно инкубированная с клеточным экстрактом млекопитающих, чтобы исключить возможность неспецифического связывания, она может связывать VHL, меченый радиоактивным изотопом серы 35S. К этому моменту уже было известно, что, если заменить каждую из 8 аминокислот этой коровой последовательности на аланины, белок останется стабильным, но потеряет сродство к VHL. Той самой, ключевой для связывания с VHL аминокислотой корового участка оказался пролин. Соединив эти знания с информацией о том, что пролилгидроксилазы используют кислород как косубстрат, исследователи предположили, что модификацией, не дающей HIF1-alpha связаться с VHL, было гидроксилирование пролина.

Позже пролилгидроксилаза HIF EglN1 была выделена. В отличие от коллагеновых пролингидроксилаз, у нее очень низкое сродство к кислороду, а значит, она очень чувствительна к изменениям уровня кислорода в физиологических концентрациях. Помимо кислорода, им нужен еще один косубстрат — альфакетоглутарат.

"В семейство EglN входят EglN1, EglN2 и EglN3, однако очевидно, что в нормальных условиях основной регулятор HIF1-alpha — это EGLN1. Поэтому ты не можешь пережить эмбриогенез по типу млекопитающего, не обладая этим геном. По крайней мере, если ты мышь".

С помощью технологии рекомбинации Сre-Lox были созданы мыши, у которых при некоторых условиях можно было отключить ген EglN1 у взрослой особи. При инактивации гена увеличилось число и размер сосудов, также наблюдалось покраснение пор. Это было следствием резкого увеличения эритроцитов в крови. Подобное состояние свойственно людям — носителям семейной полицитемии. Эти люди всегда имеют мутацию в одном из генов Vhl, EglN1 или HIF2-alpha. Также известно, что некоторые семьи (рода), адаптировавшиеся к жизни высоко в горах, имеют полиморфизмы в этом сигнальном пути.

Весь эритропоэтин, который выработали эти мыши, исходил из их почек. Однако у плода млекопитающего основной источник эритропоэтина — печень. Вскоре после рождения происходит сайленсинг печеночного EPO-локуса, а почечный EPO-локус запускается.

"Энди Минамишима хотел узнать, можно ли реактивировать печеночный EPO-локус у взрослых животных. Для этого он инактивировал белки семейства EglN поодиночке и в различных комбинациях, или отключал все три, а затем измерял уровень печеночных EPO мРНК. Отключив все три, он заметил резкий рост экспрессии гена печеночного эритропоэтина, ведущего к росту уровня EPO в сыворотке крови. Для сравнения он также выключил сам Vhl и наблюдал такие же результаты".

Клиническое применение результатов исследования

20 лет назад Кейлин сотрудничал с компанией FibroGen, которая создала для него ингибитор пролилгидроксилазы. В случае удачи можно было бы продолжить работу и сделать более специфический ингибитор HIF-пролилгидроксилазы. Ингибитор первой версии работал как на клеточной культуре, так и на мышах, которые получали препарат орально. Эффективность проверяли с помощью HIF, конъюгированного с люциферазой. Мыши, которые получали больше ингибитора пролилгидроксилазы, светились интенсивнее, так как в их организме HIF был стабилен и накапливался.

Есть также данные о второй фазе клинических испытаний препарата на пациентах с хронической дисфункцией почек. Использован ингибитор пролилгидроксилазы для орального употребления под названием роксадустат. Результаты испытаний показали, что роксадустат дозозависимо повышает уровень эритропоэтина в крови по сравнению с группой пациентов, принимавших плацебо, как на первый, так и на 29-й день применения препарата. Сейчас к публикации готовится статья с результатами третьей фазы клинических испытаний. Роксадустат уже используется в Китае, Японии, и со дня на день будет допущен к использованию в США и некоторых европейских странах.

"Если обратить внимание на преклинические модели таких заболеваний как инфаркт и инсульт, этот препарат также может оказаться полезным, но здесь все еще необходимо провести множество клинических исследований "

"Итак, болезнь Гиппеля-Линдау оказалась весьма информативной. Пациенты с Гиппелем-Линдау обычно гетерозиготны по гену Vhl. Со временем у них могут развиться сотни почечных кист, утрачивающих нормальный аллель. Так что, видимо, утрата Vhl в человеческой почке вызывает образование паранеопластических почечных кист. Спустя годы или десятилетия некоторые из кист превращаются в карциномы, и, если отсеквенировать их, то там найдутся еще и другие мутации, свидетельствующие о сопутствующих генетических событиях. Это говорит о том, что потеря гена Vhl — первый критический шаг к раку почек, но ее недостаточно, чтобы его вызвать. То же самое мы видим при изучении ненаследственного светлоклеточного рака почек".

Группа Суонтона изучала образцы опухолей из почек и также обнаружила, что потеря Vhl имела место, однако к образованию рака приводили сочетания различных мутаций. Впрочем, без потери Vhl этого не случилось бы: если у мышей с делецией Vhl восстановить содержание белка этого гена, добавляя его извне, опухоль не разовьется. При добавлении белков VHL HIF2-alpha опухоль развивается, а если добавить короткую шпильку РНК HIF2-alpha, опухоль не развивается. Таким образом, ингибирования HIF, особенно HIF2 необходимо и достаточно, чтобы VHL подавил рост опухоли в почке.

"Когда мы делали эту работу, было принято считать, что белки наподобие HIF не поддаются обработке лекарствами. Однако белки, которые он контролирует, поддаются. Самый известный из них — VEGF, так что в девяностые несколько компаний уже разрабатывали ингибиторы VEGF".

В опухолевой ткани экспрессия VEGF гораздо выше, чем в ткани, из которой выросла опухоль, но эта разница особенно велика в случае рака почки.

"К счастью, сейчас множество ингибиторов VEGF разрешено к использованию. Это привело к значительным улучшениям, и некоторые пациенты чувствуют себя хорошо годами, принимая этот препарат. Однако я вынужден отметить, что некоторые пациенты все же не отвечают на лечение, так что, очевидно, нам нужно работать лучше".

Рик Бруик и Кевин Гарднер решили проигнорировать существующую догму о том, что HIF не поддается медикаментозному влиянию, и нашли на нем карман для потенциального лекарственного воздействия, так называемый домен B-пути. Молекулы белка-лекарства могли бы связаться с ним, индуцировать аллостерические изменения, которые помешали бы ему связываться с ДНК и осуществлять функции фактора транскрипции. Cейчас усовершенствованием этих молекул занимается компания Peloton, и их препараты эффективно борются с раком почек на преклинических моделях. Сейчас он проходят третью фазу клинических испытаний.

"Сейчас пациенты с болезнью Гиппеля-Линдау организованы, у них есть виртуальное сообщество онлайн, это полезно по многим причинам, и не последняя из них — тот факт, что пациенты знают об этом заболевании больше, чем многие врачи, учитывая, насколько редко оно встречается, и готовы делиться информацией друг с другом.

Также компания Peloton согласилась лечить hif2alpha-ингибитором 50 пациентов с этим заболеванием. Данные о них еще не опубликовали, но кое-что становится известно.

"Это еще одна примета времени, в котором мы живем: пациенты пишут в соцсетях, что они отвечают на лечение. Если хорошо поискать, можно найти сканы до и после терапии, которые они публикуют. И это, разумеется, очень трогательно, потому что у этих людей всю жизнь висел над головой Дамоклов меч, они видели, как их родители, бабушки и дедушки страдают и умирают от этой болезни. Мы надеемся, что ингибитор HIF2-alpha поможет это изменить".

"Под конец я хотел бы поблагодарить мою покойную жену, доктора Кэролин Кейлин. Она была хирургом рака груди в Бостоне и сама пережила рак груди, чтобы погибнуть от глиобластомы в 2015 году. Она была моим лучшим другом, родственной душой и спутником жизни, а также матерью наших двоих прекрасных детей. Я хотел бы разделить свое признание с ней. Спасибо".

Посмотреть на PCR.news лекцию Грегга Семенцы

Посмотреть на PCR.news лекцию Питера Рэтклиффа
Добавить в избранное

Комментарии

Авторизуйтесь или зарегистрируйтесь, чтобы оставить комментарий

Вам будет интересно