Нобелевская неделя 2019. Питер Рэтклифф: «Если вы убиваете свое растение, сильно его поливая, то вы, возможно, убиваете его посредством гипоксии»

«Стало ясно, что все четыре царства эукариот используют подобную систему ферментов для детекции уровня кислорода». Лекция лауреата Нобелевской премии по физиологии или медицине 2019 года. Сольна, 07.12.2019.

Изображение:
Скриншот канала Нобелевского комитета

Перед началом своей лекции сэр Питер Рэтклифф поблагодарил Патрика Эрнфорса (Patrik Ernfors) за представление и Нобелевскую ассамблею за честь.

«Так как Грегг, Билл и я — англо-американское трио, я бы хотел начать эту лекцию с рассказа об англо-американской экспедиции на пик Пайкс (1911 год), штат Колорадо, целью которой было изучение адаптации к высотной гипоксии. Лидером экспедиции был Джон Скотт Холдейн (John Scott Haldane), но героиней этой лекции будет Мэйбл Фицджеральд (Mabel Purefoy FitzGerald) — единственная женщина в коллективе, которая не являлась членом Оксфордского университета из-за своего пола». Мейбл проводила свои исследования на промежуточных высотах и измеряла парциальное давление углекислого газа в альвеолах и концентрацию гемоглобина в крови в зависимости от высоты: «Это была демонстрация удивительной чувствительности системы регуляции в условиях гипоксии, что мы и будем сегодня обсуждать».

Ген эритропоэтина и его энхансер

Регулятором концентрации гемоглобина (количества эритроцитов) является эритропоэтин, который синтезируется в почках. В 80-е Питер как раз изучал нефрологию, и его заинтересовал вопрос: что является сенсором кислорода и стимулирует синтез эритропоэтина: «Мы думали, что найдем очень специфический сенсор в очень специфических клетках почек, которые измеряют количество кислорода и производят эритропоэтин. Проблема была в том, что их не обнаружили в почке, и мы не могли работать с удобной культурой клеток».

Группа Рэтклиффа нашла эти клетки в почках трансгенных мышей, у которых эритропоэтин экспрессировался совместно с SV40 T-антигеном. Антиген был маркером, и исследователи выявили группу клеток, синтезировавших эритропоэтин, которые оказались обычными межтканевыми фибробластами (Maxwell et al., 1993). Тем временем, группа Франклина Банна (Franklin Bunn) показала, что клетки гепатомы — опухоли печени — также синтезируют эритропоэтин в ответ на гипоксию в культуре (Goldberg et al., 1987).

И группа Рэтклиффа, и группа Семенцы пытались картировать регуляторные области гена эритропоэтина, чтобы понять работу сенсорного пути. Ратклифф с Кристофером Пью (Christopher Pugh) описали энхансер, лежащий рядом с 3′-концом гена Epo в клеточных линиях гепатомы (Pugh et al., 1991). Его наличие повышает экспрессию гена при низкой концентрации кислорода. Затем они трансфецировали другие клетки, нечувствительные к изменению кислорода, плазмидой с геном-репортером, связанным с описанным энхансером. Оказалось, что эти клетки также способны реагировать на снижение концентрации кислорода (Maxwell, Pugh, Ratcliffe, 1993). Возможно, в них сенсорная система регулировала другие гены, не Epo.

«Я был очень впечатлен работой, написал статью... Я повез рукопись в офис известного журнала в Лондоне. Моей целью было ворваться в офис, найти редактора: чтобы он сразу оценил значимость этой работы и согласился опубликовать ее... Вот что мы получили спустя четыре месяца: «...нам было очень сложно подобрать рецензента». Для молодых людей: если вам такое говорят, это хорошо, это значит, что вы в очень узкой области. Это облегчит вам жизнь».   

Регуляция работы HIF

«Грегг сделал великолепную работу, определив, что HIF связывается с нашей последовательностью (HRE — hypoxia response element). Мы встретились в отеле в Люцерне (Швейцария). Он выступил с неопубликованными данными про идентификацию HIF в клетках гепатомы, я презентовал работу, которую только что описал. Это мы, сосредоточенно обдумываем дальнейшие действия. По фотографии не скажешь, но этот отель был самым шикарным местом, где мы оба когда-либо были. И вряд ли побывали бы еще, если бы не приехали сюда».

После этого группа Рэтклиффа нашла другие гены, которые регулируются в ответ на снижение концентрации кислорода: кодирующие фосфоглицераткиназу 1 и лактатдегидрогеназу А — ферменты энергетического метаболизма, в частности — гликолиза (Firth et al., 1994). Также в клетках дрозофилы они описали HIF-подобные факторы, которые под действием гипоксии взаимодействуют с сайтами посадки HIF-1 (Nagao et al., 1996).

«Нам хотелось пойти вверх от HIF-1 по сигнальному пути... И мы хотели понять, что дает HIF-1 возможность быть чувствительным к кислороду». Так лаборатория Рэтклиффа совместно с другими коллективами обнаружила три регуляторных участка у HIF-1α. На тот момент уже было известно, что одним из способов передачи сигнала было фосфорилирование белков. Тем не менее, гипотезу о фосфорилировании HIF-1α опровергли: в одном из регуляторных участков аминокислоты, акцептирующие фосфат, не играют роли в активности белка.

Потом исследователи определили, что эти регуляторные последовательности HIF-1α взаимодействуют с белком VHL (Von Hippel–Lindau) (Maxwell et al., 1993). «Это был момент истины в нашей лаборатории. В клетках с мутацией в гене VHL количество HIF-1α не менялось. Но если вернуть им VHL, HIF-1α снова приобретает способность реагировать на гипоксию». Группа Уильяма Кэлина показала, что в клетках рака почки с мутацией в VHL HIF-1α также присутствует вне зависимости от концентрации кислорода.

HIF-1 имеет PAS домен, и в геноме человека нашли еще один белок с таким доменом, который мог являться паралогом HIF-1, и назвали его EPAS-1 (Endothelial PAS domain protein 1). «Нужны были антитела, чтобы подтвердить чувствительность EPAS-1 к кислороду. Патрик Максвелл (Patrick Maxwell) из нашей лаборатории сделал такие антитела, PM9 — Patrick Maxwell 9». Оказалось, что некоторые клетки синтезируют только EPAS-1, который назвали HIF-2.

Таким образом, VHL — убиквитин-лигаза, которая в присутствии кислорода связывает HIF-1 и отправляет его на деградацию в протеасомы. «Мы задались биохимическим вопросом: что в клеточном экстракте позволяет этим белкам связывать друг друга?». Исследователи выяснили, что в присутствии кислорода происходит гидрокисилирование двух пролинов в регуляторном участке HIF-1. Это и повышает сродство белка к VHL (Stolze et al., 2006). Так как гидроксилирование происходит с участием кислорода, реакция является сенсором его наличия.

Рэтклифф упоминал о факторах, подобных HIF-1 у дрозофил. Также его лаборатория исследовала мутантных C. elegans и обнаружила, что мутация в гене egl-9 приводит к независимому от концентрации кислорода присутствию CeHIF-1. Таким образом, они нашли пролилгидроксилазу EGL-9 у червей, которая регулирует стабильность CeHIF-1 (Epstein et al., 2001). «Вам не нужна лицензия, никакой экспертизы, бедные черви... все они испытывали гипоксию».

«То есть эти ферменты расщепляют молекулу кислорода и добавляют его атом к пролину. Пролин связывается водородными связями с VHL, который способствует деградации HIF в присутствии кислорода. Это — переключатель, он регулирует ответные реакции на гипоксию. О них вы слышали от Грегга, их впервые отметила Фицджеральд в шахтерских городах Дикого Запада в Колорадо. Вот снова она... и ее измерения концентрации гемоглобина в крови, которая зависит от переключения HIF».

Сравнение с растениями и еще один фермент-регулятор

«Казалось, что HIF, пролилгидроксилазы, VHL в такой форме есть только у многоклеточных животных. Но в какой-то момент стало ясно, что все четыре царства эукариот используют подобную систему ферментов для детекции уровня кислорода». Дальше лауреат сравнивает описанные системы грибов, животных, протистов и растений. Интересно, что последние вместо пролилгидроксилаз используют цистеиноксидазы, которые окисляют цистеин белков ERF (ethylene responsive factor). Эти белки являются растительными аналогами HIF, окисление цистеина приводит к их деградации. «ERF отвечают за реакцию растения на затопление. Если вы убиваете свое растение, сильно его поливая, то вы, возможно, убиваете его посредством гипоксии... Растение адаптируется и останавливает деградацию транскрипционных факторов ERF».

Лаборатория Питера решила поэкспериментировать с растительными факторами и ввела ген ERF в клетки человека. Оказалось, что его присутствие в этих клетках также зависит от кислорода, как и наличие HIF. В случае замены цистеина на аланин у ERF белок стабилизировался. Значит, в клетках человека также есть фермент, окисляющий цистеин и участвующий в регуляции ответа на гипоксию (ADO). Если его экспрессировать в мутантном Arabidopsis Thaliana, у которого выключены четыре из пяти цистеиноксидаз, то растение возвращается к исходному фенотипу. Также исследователи показали, что ADO регулирует белки RGS, которые участвуют в сигналинге G-белков (Masson et al., 2019). Интересно, что HIF также взаимодействует с белками RGS.

Как все эти знания можно применить на практике? У пациентов с почечной недостаточностью снижается уровень эритропоэтина, из-за чего возникает анемия. «Билл подробнее расскажет про это: ингибиторы пролингидроксилаз показывают хорошие результаты (повышение гемоглобина) у пациентов с почечной анемией... Но… «You can't always get what you want // But if you try sometime you find // You get what you need» — слова Мика Джаггера и Кита Ричардса. Конечно, не понаслышке они кое-что понимали в разработке препаратов... Но на данный момент эти результаты для ингибиторов выглядят достаточно хорошо».

В конце лекции Питер Рэтклифф поблагодарил прошлых и настоящих коллег, спонсирующие организации, коллабораторов, жену и семью.

Посмотреть на PCR.news лекцию Грегга Семенцы

Посмотреть на PCR.news лекцию Уильяма Кейлина

Добавить в избранное

Комментарии

Авторизуйтесь или зарегистрируйтесь, чтобы оставить комментарий

Вам будет интересно