Нобелевская неделя 2020. Майкл Хоутон: «Длинный и извилистый путь к идентификации и выделению вируса гепатита С»

«Это было, полагаю, рождением области исследования гепатита С». Лекция лауреата Нобелевской премии по физиологии или медицине 2020 года. 07.12.2020

Изображение:
Скриншот канала Нобелевского комитета

Нобелевский лауреат доктор Майкл Хоутон начал лекцию с того, что представился и сказал, что в настоящее время работает в Альбертском университете, Эдмонтон, Канада.

«Я расскажу вам о работе по идентификации и выделению вируса гепатита C, которую выполнили мои коллеги и я между 1982 и 1989. Моя работа над вакциной против вируса гепатита C продолжается в Альбертском университете, но сегодня я сосредоточусь на работе, которую мы выполнили, идентифицируя вирус в 80-е».


Поиски возбудителя NANBH

В 1982 году Майкл Хоутон присоединился к Chiron Corporation, стартапу, который был основан доктором Раттером и доктором Пенхотом из Калифорнийского университета. Внимание Хоутона привлек «гепатит ни A, ни B» (Non-A, non-B hepatitis; NANBH). Хоутон с командой сразу столкнулись с трудностями при попытке идентифицировать причину NANBH.

Дело в том, что в 1982 году у них на руках было не так уж много инструментов. Да, были зараженные материалы от людей и шимпанзе из разных уголков мира. Но ПЦР еще на была изобретена, не были открыты антигены или антитела к NANBH, не было системы культуры клеток, не было высокопроизводительного секвенирования. Не было всего того, что облегчает исследования современным ученым. Тем не менее, команда Хоутона взялась за дело.

Работа началась с коллаборации с доктором Тацуя Миямура из Национального института здоровья Японии. Он предоставил образцы печени людей, умерших от NANBH и NANBH-инфицированную кровь. Однако качество РНК, которую удалось извлечь из печени, было очень низким из-за деградации in vivo.

Нужна была животная модель.

Хоутон обратился к доктору Брэдли из Центра по контролю и профилактике заболеваний США. У того как раз была модель NANBH на шимпанзе, и он согласился предоставить образцы.

«Основным анализом, которым мы оперировали в то время, была “плюс-минус” гибридизация. В общих чертах, мы клонировали полиаденилированную мРНК из инфицированной печени. До этого мы конвертировали ее в кДНК обратной транскриптазой. Мы клонировали кДНК в бактериальные колонии, переносили колонии на фильтровальную бумагу. Эти фильтры можно дуплицировать. У вас получается набор одинаковых отпечатков бактериальных колоний с библиотеками. Мы гибридизовали радиоактивную кДНК, которую получали из РНК инфицированной печени или из РНК контрольной неинфицированной печени. И мы искали сигналы, где произошла гибридизация с кДНК инфицированной печени, но не здоровой печени. Трудоемкий процесс».

В конце концов Хоутону с коллегами удалось только идентифицировать гены, которые экспрессировались сильнее при инфекции, но ни одна из найденных ими молекул кДНК не была вирусной, потому что все они гибридизовались на геномную ДНК человека или шимпанзе.

В 1984 году Хоутон попросил Брэдли найти им образцы зараженных NANBH шимпанзе с более высоким титром инфекционности. В конце концов был найден образец шимпанзе #910. В пуле из нескольких образцов этого шимпанзе удалось добиться титра инфекционности в 1 миллион CID50 в плазме, а в печени — 10 миллионов CID50 на грамм.

Но снова гибридизационный подход не позволил идентифицировать вирусную, нехромосомную кДНК.

Далее команда Хоутона пробовала гибридизацию с другими вирусами, которые теоретически могли иметь схожую структуру с NANBH вирусом (HBV, HAV, YFV, BVDV). Были выбраны высококонсервативные области, но снова безуспешно.

Ранее были получены данные, что NANBH вирус может быть схож по строению с вирусом гепатита D, дельта-вирусом. Было высказано предположение, что они имеют схожий сиквенс. В сотрудничестве с доктором Джоном Джерином был идентифицирован геном дельта-вируса. Это кольцевая одноцепочечная РНК, более сходная по строению с вироидами растений. Но идентификация и выделения генома дельта-вируса не помогли в идентификации NANBH вируса. Геном дельта-вируса гибридизировали на библиотеки, полученные из NANBH-инфицированных печени и плазмы. Гибридизация не произошла.

Группой Хоутона было испробовано множество подходов: культивирование в клеточных линиях, поиск активности обратной транскриптазы на случай, если это ретровирус, поиск больших вирусных РНК или ДНК геномов на электрофорезе, попытка произвести моноклональные антитела, но все было безуспешно.

Примерно в это время доктор Янг и доктор Дэвис из Стэнфордского университета разработали кДНК-экспрессионную систему на основе бактериофага λgt11 (высокоэффективный вектор для клонирования). Эта система позволяла производить очень большие протеомные библиотеки. Было показано, что, используя высокоспецифичные антитела, можно извлечь клоны кДНК из таких библиотек.

«В начале программы я и другие считали это очень рискованным подходом, по нескольким причинам. Первая — он не всегда работал, даже когда были доступны хорошие антитела. Никаких антител не было идентифицировано для NANBH к тому моменту. Стойкость NANBH заставляла предполагать, что иммунный ответ на этот вирус может быть слабым».

Но доктор Джордж Кюо высказал предположение, что проблема в обнаружении антител может происходить от малой концентрации антигенов. Обычно использовали образцы печени. Но как раз кДНК-экспрессионный вектор может помочь решить эту проблему и найти антитела, а потом и клоны с вирусной кДНК.

Брэдли тоже был за этот подход и предоставил плазму шимпанзе #910.

Хоутон сделал λgt11 библиотеки из полиаденилированной мРНК из 4 образцов печени шимпанзе с NANBH от доктора Брэдли. Доктор Чу провел скрининг, используя сыворотку из выздоравливающих шипанзе и людей. Потом использовали плазму шимпанзе #910.

Но вирусная ДНК так и не была обнаружена. «Это было время разочарований», — признался Хоутон.

Вирус найден в человеческой сыворотке

Команда взяла перерыв и попыталась валидировать λgt11-систему, используя вирус гепатита D. Им это удалось с большим успехом. Однако титр инфекционности у обезьяны с вирусом гепатита D был в 100 000 раз выше, чем в плазме NANBH-инфицированной шимпанзе #910. Тем не менее, было принято решение продолжить.

Хоутон сделал вторую кДНК λgt11-экспрессионную библиотеку из кДНК из плазмы шимпанзе #910. Но в этот раз Чу и Хоутон решили использовать сыворотку пациента из США с необычайно высоким уровнем аланинаминотрансферазы (ALT). Они предположили, что и титр инфекционности у такого пациента будет высоким.

И вот после 6 лет с начала работы к команде пришел успех. Были ложноположительные результаты, но был получен и один клон 5-1-1, который содержал вирусную кДНК, всего 100 пн.

Брэдли предоставил образцы шимпанзе, зараженных NANBH вирусом, HBV и HAV. Сероконверсия к 5-1-1 была обнаружена только у шимпанзе с NANBH, но не у остальных.

5-1-1-специфичные антитела наблюдались у 7 из 11 клинически диагностированных NANBH-пациентов и у 0 из 10 контролей (образцы от доктора Гэри Гитника).

Постепенно был получен сиквенс всего вирусного генома. Этот вирус содержит большую одноцепочечную (+)РНК. У него одна ORF, и по строению он имеет некоторую схожесть с вирусом Денге.

Доктор Харви Алтер создал панель из сыворотки зараженных и незараженных образцов. Радиоиммуноанализ с клоном 5-1-1 показал взаимодействие только с зараженными NANBH-вирусом образцами. Были успешно идентифицированы пациенты с NANBH со всех концов света. Но интересно, что в образцах выздоровевших пациентов удалось идентифицировать только 2 из 13 случаев (15%), что показывает, что пациенты с острым NANBH и последующим выздоровлением имеют намного меньшие титры антител, чем при хронической форме.

Итак, в 1989 году поиск вируса был завершен двумя публикациями в Science. Рассказывая о содержании этих публикаций, доктор Хоутон особо отметил вклад доктора Оверби, специалиста по гепатиту.

Фундамент для диагностики гепатита C

Был секвенирован весь геном вируса гепатита С, он состоит из 9 050 нуклеотидов, которые транслируются в один большой полипротеин-прекурсор. Этот полипротеин затем разрезается ферментами вируса и клетки-хозяина на несколько белков.

«Это было, полагаю, рождением области исследования гепатита С. Теперь ученые, работники индустрии и общественного здравоохранения могут использовать информацию о геноме для разработки методов диагностики».

Со временем команда Хоутона предоставляла все более и более чувствительные методы детекции, основанные на антителах.

«5’-нетранслируемая область вирусного генома обладает очень четкой вторичной и третичной структурой, с ней связываются рибосомы для инициации трансляции белка. Мой коллега доктор Хан показал, что это высококонсервативная область генома, а потому она изящно подходит для ПЦР и ОТА [TMA, transcription-mediated amplification, опосредованная транскрипцией амплификация] детекции РНК в образцах».

Таким образом, были разработаны диагностические системы, основанные не только на использовании антител, но и на прямой детекции РНК.

Активно изучались такие гены вируса гепатита C, как NS5b, кодирующий репликазу, NS5a. Репликаза вовлечена в сбор вирусной частицы и секрецию и является важной целью для производства антивирусных препаратов. NS3 кодирует протеазу, которая также является целью антивирусной терапии. А два гена, кодирующие белки оболочки, — gpE1 и gpE2 — группа Хоутона использует в настоящее время для разработки вакцины.

В финале лекции доктор Хоутон еще раз поблагодарил своих коллег доктора Ки-Лим Чу, доктора Джорджа Кюо, доктора Дэниела Брэдли, а также Нобелевский комитет.

Посмотреть на PCR.news лекцию Чарльза Райса.

Посмотреть на PCR.news лекцию Харви Альтера

Добавить в избранное

Вам будет интересно