Oxford Nanopore: инструменты будущего для секвенирования геномов

Нанопоровое секвенирование относится к методам секвенирования третьего поколения. Молекула нуклеиновой кислоты проходит через пору в мембране, при этом изменения ионного тока конвертируются в нуклеотидную последовательность. Секвенаторы, основанные на этом принципе, предлагает британская компания Oxford Nanopore Technologies (ONT), ее официальный дистрибьютор в РФ и СНГ — компания SkyGen.

Один из главных плюсов нанопорового секвенирования — возможность прочтения протяженных фрагментов. Длина ридов достигает сотен тысяч и даже миллионов нуклеотидов, тогда как у традиционных методов NGS — сотни нуклеотидов. Длинные прочтения позволяют выполнять сборку сложных участков, в которых много повторов или структурных перестроек. С другой стороны, всем известно, что точность нанопорового секвенирования ниже, чем у привычных методов NGS, а пути преодоления этой проблемы известны не всем. Есть и понятное недоверие к новому. Кому-то рассказал коллега, что их лаборатория приобрела MinION и «ничего не получилось», кто-то не хочет рисковать, меняя знакомое на незнакомое. Но и в таком подходе есть минусы: возможно, преимущества нанопорового секвенирования использует конкурирующая лаборатория и быстрее решит вашу общую задачу.

В этом материале мы постарались развеять некоторые типичные опасения начинающих по поводу нанопорового секвенирования. А потом поговорили с учеными, которые уже секвенируют с помощью приборов ONT.

Разрушение мифов

Какова сейчас максимальная длина прочтений у ONT?

На данный момент максимальная длина 4 млн п.н. Это позволяет исследовать области, труднодоступные для секвенирования другими методами, и увеличить область покрытия.

Однако длина прочтений зависит от длины фрагментов ДНК, которая, в свою очередь, ограничивается способом выделения. Например, для NEB Monarch Genomic DNA kit это 50–70kb (согласно информации от производителя).

Сколько времени уходит на пробоподготовку и секвенирование? Какого выхода можно ожидать?

Минимальное время на пробоподготовку набором Rapid — 10 минут. Для другого популярного набора, Ligation, это время составляет 60 мин. Естественно, с этапом ПЦР пробоподготовка будет дольше. Время пробоподготовки для всех наборов можно посмотреть на сайте SkyGen.

Скорость секвенирования в ячейке Nanopore составляет 420 оснований в секунду. Выход определяется количеством ячеек в приборе. Максимальный на данный момент выход, 14 терабаз, достигается на PromethION 48 за 72 часа. Для миниатюрного секвенатора MinION максимум за те же 72 часа — 50 Gb. Но даже и это много. Традиционные платформы NGS предлагают выходы от единиц до сотен гигабаз за аналогичные промежутки времени.

 Секвенаторы Oxford Nanopore. Credit: ONT

Подходит ли ONT для секвенирования SARS-CoV-2?

Да. Чтобы обеспечить оперативное секвенирование геномов нового коронавируса, исследователи эпидемий в сотрудничестве с ведущими научными центрами создали протокол ARTIC SARS-CoV-2. Протокол основан на прямой амплификации вирусного генома с использованием мозаичных мультиплексных праймеров. Этот подход дает высокую чувствительность и работает на клинических образцах. Один из примеров — полногеномное секвенирование SARS-CoV-2 из образцов, собранных в Ханчжоу (Китай) в начале 2020 года. Филогенетический анализ геномных вариаций, выявленных в этой работе, указал на множественные источники инфекции и различные модели передачи.

Материалы, которые предоставляет ARTIC, — набор праймеров, лабораторные протоколы, пособия по биоинформатике и наборы данных, — в основном ориентированы на портативный секвенатор Oxford Nanopore MinION. Однако схема праймеров и амплификация образцов могут быть распространены на другие платформы. Поскольку для удобства работы с образцами РНК, деградированными при хранении и экстракции, выбрали небольшую длину ампликонов (около 400 п.н.), это позволяет работать по протоколу ARTIC SARS-CoV-2 на Illumina.

Специалисты New England Biolabs считают, что секвенирование по протоколу ARTIC одинаково эффективно в версиях для Illumina и ONT.

Подробнее о нанопоровом секвенировании SARS-CoV-2 можно прочитать на сайте производителя.

Секвенирование на приборах ONT дорогое или дешевое?

Стоимость целесообразно измерять в цене секвенирования 1 Gb. Минимальная стоимость секвенирования 1 Gb в 2020 году, по данным Национального института исследований генома человека США, — около 8 долларов. Реальные цены, которые анонсируют поставщики оборудования для NGS, обычно бывают выше — десятки долларов за гигабазу. Нанопоровое секвенирование вписывается в этот диапазон, причем самые дешевые варианты приближаются к нижнему пределу. Стоимость варьирует в том числе из-за различия цен на ячейки. Производитель предлагает разные их версии, кроме того, ячейки на PromethION отличаются от ячеек для MinION и GridION, и цена любых ячеек может снижаться при покупке оптом.

Как избежать кроссконтаминации при прогоне образцов в одной ячейке?

Наборы для промывки ONT, содержащие нуклеазы, позволяют удалить 99,99% образца, а также восстановить функциональность пор. Повторные промывки могут увеличить общий выход с ячейки как минимум вдвое. При этом промывка не влияет на длины прочтений.

Чтобы избежать кроссконтаминации остаточными количествами образца, которые могут остаться после промывки, следует использовать баркоды.

Технология баркодирования, или мультиплексирования, применяется, когда количество данных, необходимых для анализа одного образца, меньше количества данных, которые можно получить с одной проточной ячейки. Образцы пулируют и секвенируют вместе, что позволяет более эффективно использовать ячейку, а также снизить стоимость секвенирования. Аналогичным образом баркоды позволяют отличить загрязнения, оставшиеся от предыдущего прогона.

Повторное использование ячеек — это стремление лабораторий сэкономить, или ячейки на это рассчитаны?

Ячейки можно использовать многократно, пока есть функциональные поры. Например, набор для сверхдлинных прочтений включает в себя реагенты для трех загрузок одной и той же библиотеки.

Даже если после запусков остается всего несколько десятков пор, можно секвенировать, например, ампликонные библиотеки. Количество активных пор показывает программное обеспечение, выглядит это примерно так:

Ходят слухи, что качество ячеек варьирует. Так ли это? Что делать, если попалась «плохая» ячейка?

Варьирует количество пор в ячейках. Если оно не соответствует гарантийному в гарантийный период, то производитель с готовностью заменит ячейку.

Говорят о высоком проценте ошибок у ONT по сравнению с Illumina и другими NGS-методами. Можно ли повысить качество?

Качество повышается при повышении покрытия. На данный момент качество консенсусной последовательности Q40 (1 ошибка на 10 000 нуклеотидов) достигается при покрытии 200x.

В планах ONT достижение качества консенсусной последовательности Q60 (1 ошибка на миллион оснований). Для этого совершенствуются реагенты, структура пор, протоколы анализа данных, а также используются комбинации данных, полученных с помощью ячеек разного типа. Уже сейчас с помощью ячеек R10 можно повысить точность консенсусной последовательности за счет лучшего прочтения гомополимерных участков. (Подробнее на PCR.NEWS о новой химии и R10.)

Насколько важен опыт работы с приборами ONT для получения качественных сиквенсов?

Навык необходим, как и в других методах NGS, но гибкая система ONT позволяет избегать критических ошибок даже на первых этапах и без проблем накапливать опыт. На приборах ONT можно в любой момент приостановить секвенирование и перезапустить его с оптимизированными параметрами. Оборудование не требует настройки, и вся линейка секвенаторов работает под управлением единственного ПО MinKNOW.

При инсталляции оборудования пользователи обязательно проходят обучение по пробоподготовке и запуску секвенирования, в ходе которого сразу секвенируют собственные образцы. ONT осуществляет постоянную техническую поддержку. Клиенты из РФ и СНГ могут обратиться за помощью в SkyGen. А еще у ONT есть свой портал — Nanopore Community, где хранятся все протоколы, много статей, есть возможность общаться с другими пользователями и получить поддержку технических специалистов. К Community подключают всех желающих с базовым (ознакомительным) доступом, а при покупке прибора и ячеек открывается полный доступ.

 Credit: ONT

В конце прошлого года мы рассказывали о российском опыте работы на большом нанопоровом секвенаторе PromethION 24. В этот раз мы поговорили с исследователями, которые секвенируют на MinION. Этот миниатюрный секвенатор — самый распространенный в нашей стране из всей линейки приборов ONT.

 Credit: ONT

«Мы наконец-то можем посмотреть, что там, на темной стороне генома»

Кандидат биологических наук Илья Киров — старший научной сотрудник в лаборатории маркерной и геномной селекции растений ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии. В лаборатории есть прикладное направление исследований — поиск генов зерновых культур, вовлеченных в хлебопекарное качество зерна, и второе, более фундаментальное, — мобильные элементы в геномах растений. Секвенирование на MinION используют для обоих направлений.

Credit: 123rf.com

— Мобильные элементы бывают разной природы, но их объединяет одно: это повторяющиеся элементы генома, — объясняет Илья. — Много одинаковых копий по всему геному разбросано. Это как сборка пазла: самое трудное — участки одного цвета. С этим сталкиваются люди, если используют для анализа генома обычные короткие прочтения. Они берут короткие риды и пытаются собрать геном. Когда при анализе вдруг встречаются повторяющиеся мотивы, программа не знает, куда их поставить. Откуда пришел этот рид? От элемента на первой хромосоме, на пятой или на десятой? Если собирается геном, то эти элементы часто не включаются в финальную версию генома или представлены там в сильно меньших количествах, чем в реальности. А если собирается транскриптом, тогда даже если этот элемент будет экспрессироваться, мы этого не увидим. Для растений это очень актуально, потому что геномы самых главных наших сельхозкультур — кукурузы, пшеницы, ржи — на 90% могут состоять из мобильных элементов. Оказывается, что на 90% генома мы просто закрываем глаза. Длинные риды — это как собрать тот же пазл, только крупными деталями. Открываются колоссальные возможности. Мы наконец-то можем посмотреть, что там, на темной стороне генома, до которой мы добраться не могли.

Как давно вы работаете на оборудовании ONT?

C Nanopore мы ровно год. Начали с прямого секвенирования РНК, и уже ДНК секвенируем на потоке. Используем наиболее продвинутые технологии. Разрабатываем методы, которые позволяют секвенировать только определенный участок генома, а не весь геном. Для этого мы получаем длинные риды, на порядок длиннее, чем у Illumina. И для нас это выход, мы можем сказать, откуда пришел тот или иной элемент, транскрибируется он или не транскрибируется. В том году как раз вышли две статьи у нас на эту тему, о подсолнечнике и тритикале.

Насколько быстро получилось освоить нанопоровое секвенирование?

История с нанопоровым секвенированием у нас началась, когда мы работали в ИБХ, года три назад. Чтобы его освоить, мы посещали семинары, которые устраивал SkyGen. Я им очень благодарен, потому что там показывали, как это все капается. Конечно, этого было недостаточно. Сто раз увидеть — это ничего не значит. Потом мы ходили по другим институтам, пробовали. В конце концов сами купили прибор, MinION. Когда купили, из компании SkyGen пришел специалист и все показал. Следующий эксперимент через несколько дней мы уже делали сами, и даже еще лучше получилось. У нас всегда есть поддержка со стороны SkyGen. Сейчас она уже не нужна, мы сами кому хочешь все покажем, но тогда это было очень важно.

Какие у вас впечатления от ONT?

Для нас это основной инструмент, других вариантов практически нет. Сейчас по два-три раза в неделю запускаем его для разных проектов. Мы в восторге. Есть ограничения и трудности, но пока нет выбора. Очень хорошо все манипуляции делать у себя в лаборатории, никуда не отдавать. Самый большой плюс в том, что все секвенирование идет на твоих глазах, тут же появляются сиквенсы на рабочем столе, мы их сразу анализируем и, если понимаем, что что-то не так — длина ридов не устраивает, информация не та, которую мы ожидали, — мы тут же останавливаем процесс, не убивая ячейку. Оставляем ее храниться до следующего эксперимента. Эксперимент получается гибкий. Это очень ускоряет исследование.

Вы уже знаете, как бороться с теми трудностями, которые возникают в процессе работы?

В целом да. Частные трудности появляются просто потому, что мы используем немного другие протоколы, не стандартные. В том числе и те, которые мы сами разрабатываем.

Получается, что вырастает целая область применения нанопорового секвенирования, куда нельзя встроить другие методы?

Да. И для изучения растений это было большое достижение, потому что геномы растений большие, у них очень много повторов, и они очень вариабельны. Два сорта кукурузы брали, у них на 30% геномы различаются! Берем растения одного вида, которые рядом растут, и видим благодаря Nanopore колоссальную вариабельность. Ее никак по-другому не накроешь. Информация, которую мы получали короткими ридами, достаточна для некоторых задач, но если мы хотим посмотреть что-то более глубокое, технически сложное для анализа, остается только Nanopore и длинные риды.

«Nanopore я использую немного не классически»

Алексей Бойко — младший научный сотрудник лаборатории сравнительной цитологии Национального научного центра морской биологии им. А.В.  Жирмунского ДВО РАН. Во Владивостоке много десятилетий работают с моллюсками и иглокожими — морскими лилиями, голотуриями. Иглокожие известны своей колоссальной способностью к регенерации внутренних органов. Голотурия выбрасывает в сторону агрессора кишечник с ротовым аппаратом и даже органы дыхания, и все это быстро регенерирует. Секрет этого феномена, очевидно, в геноме.

 Объекты, непривычные для большинства биологов: эупентакта обманщица Eupentacta fraudatrix и дальневосточный трепанг Apostichopus japonicus

— Мы планируем в этом году делать секвенирование единичных клеток во время регенерации, чтобы понять, во-первых, какие гены активируются, во-вторых, отследить уровень активности этих генов. И затем построить регуляторные сети и прийти к какому-то мастер-гену, который регулирует весь процесс. Нам нужен будет геном для этих целей. Дело в том, что геномы наших видов голотурий еще не отсеквенированы. На данный момент есть геномы, по-моему, двух видов: естественно, дальневосточного трепанга, и еще недавно сделали геном Holothuria glaberrima. Но оба они из других отрядов, использовать их геномы для наших задач не получится.

То есть вы секвенируете геномы де-ново?

Ну да. Несколько лет назад мы делали транскриптомы де-ново, сейчас перешли на уровень генома.

Как давно вы работаете на оборудовании Nanopore?

MinION нам поставили примерно в 2018 году. Сначала он был не сильно загружен. Наша лаборатория много секвенирует, но мы обычно делали библиотеку для секвенирования, и потом ее куда-нибудь отправляли, в ту же Москву. В Океанариуме — это филиал нашего института — есть MiSeq, прибор Illumina. Но MiSeq для наших задач не подходит, он больше для маленьких геномов и транскриптомов. А геном голотурии достаточно большой, он всего в три раза меньше, чем человеческий, то есть где-то одна гигабаза длиной. Поэтому мы планируем гибридную сборку: будем брать длинные риды Nanopore и короткие прочтения секвенатора BGI. В дальнейшем планируем собрать его до уровня хромосом.

Nanopore я использую немного не классически. Классический протокол не предусматривает экстрадлинных прочтений, больше сотни тысяч нуклеотидов, — они получаются единичными. Считается, что это происходит из-за естественной первичной фрагментации ДНК во время выделения и работы с ней. Еще проблема — чистка на магнитных частицах, которая ломает ДНК. Но есть интересный протокол, который заменяет эту чистку осаждением в центрифуге. Я его нашел в Интернете, он изначально висел в комьюнити Nanopore на их сайте, потом еще были небольшие вариации. Вот этот протокол позволяет получать прочтения большего размера — у нас были по полмиллиона нуклеотидов, по миллиону. Тоже единичные, но тем не менее. Надеемся, что это поможет собрать хороший геном. Кстати, Nanopore — молодцы. Видимо, поняли, что люди недовольны фрагментацией, и недавно выпустили набор, который позволяет получать очень большие риды, как раз за счет того, что убрали этот шаг чистки на магнитных частицах.

А кто-то еще в институте, кроме вас, работает на MinION?

Еще лаборатория фармакологии, они делали транскриптом немертин, которые вырабатывают нейротоксин.

Какие у вас впечатление от работы с Nanopore?

Когда я услышал об этой технологии, изначально был в восторге от нее. Она крайне гибкая, и если та же Illumina очень сильно зависит от инструментария, от банального разрешения оптики в приборе, — Nanopore не зависит от этого. По факту, он зависит от программной составляющей. Они даже советуют никогда не терять первичные данные, графики ионного тока, потому что, чем дальше развивается программа-basecaller, которая распознает сами нуклеотиды, тем лучше результат. А у них постоянно идет улучшение ПО.

Я сам считаю, что и подготовка, и запуск — все это очень легкое. Но есть нюансы. В основном они возникают, когда работа идет с экзотическими животными — для нас голотурии не экзотические, но это не стандартный модельный вид, на котором все работают. ДНК, выделенная из наших голотурий, содержит большое количество полисахаридов, которые забивают поры. В результате у нас очень быстро умирали ячейки. Это было грустно. Смотришь — другие люди сутки посеквенировали, почистили и снова секвенируют, а у нас за сутки умирают ячейки, чистка не помогает.

Потому что чистка не для полисахаридов?

Ну да, чистка рассчитана на то, чтобы смыть какие-то ионы, соли, старую ДНК. В общем, есть нюансы, которые нужно знать, желательно до начала работы. В протоколах, в требованиях к чистоте образца, не пишут, что нужно его чистить от полисахаридов, а я, например, не подумал об этом. Потом только понял, поговорив с инженером. Но теперь я знаю, чего нужно бояться.

С данными, в принципе, все хорошо. Если брать продуманную реактивику, четко под приложение, например, набор для очень больших прочтений, — тут вообще грех жаловаться. Аппарат выдает то, что от него требуется: действительно большие риды. А чтобы поправить качество, есть маленькие прочтения.

Партнерский материал