Полимеразы, обратные транскриптазы и другие ферменты: примета времени

Мы поговорили c Марией Камневой и Александром Челкиным о том, какую продукцию предлагает «Гентерра», какими объемами она оперирует, а также о возможностях кастомизации заказа.

 Изображение: Мария Камнева, заместитель коммерческого директора АО "Гентерра" Credit: Гентерра

Мария, расскажите, пожалуйста, какие ферменты предлагает ваша компания? В чем их особенности?

В первую очередь мы предлагаем TaqF ДНК-полимеразу для так называемого горячего старта. Активация фермента происходит только после прогрева смеси, а при более низких температурах этот фермент в реакцию не вступает. Как следствие, вы получаете только специфичный продукт, что минимизирует ложноположительные результаты в диагностике. Не менее важно это и в научных исследованиях, когда вам надо изучить функционирование неизвестного гена или получить генно-инженерную конструкцию.

Также этот фермент применяют при one-step анализе РНК, когда в одной пробирке одновременно проходит реакция обратной транскрипции с последующей ПЦР. Тогда у нас на первом этапе при 50–60⁰C участвует только ревертаза (обратная транскриптаза), и только после этого идет активация TaqF ДНК-полимеразы и начинается амплификация ДНК. Кроме того, у нас в каталоге есть и обычная Taq ДНК-полимераза, которая находит применение в рутинных исследованиях.

Также в нашем каталоге есть термолабильная урацил-ДНК-гликозилаза. Она помогает минимизировать контаминацию короткими фрагментами ДНК (ампликонами). Если в лаборатории проводится много исследований, но нет зонирования помещений или оно плохо налажено, то оброненная пробирка может привести к загрязнению помещения ампликонами. Это совершенно не опасно для человека, но полностью блокирует работу лаборатории, так как эти ампликоны будут приводить к ложноположительным результатам. Вот представьте — вы разливаете ампликон, содержащий последовательность нуклеотидов из генома коронавируса и после этого все пробы, которые вы проверяете, определяются как положительные. И отмыть лабораторию очень сложно и иногда это занимает недели.

Чтобы избежать таких ситуаций, в смесь нуклеозидтрифосфатов добавляют 2’-дезоксиуридинтрифосфат, который похож на тимидин и, как следствие, может быть встроен в ампликон ДНК-полимеразой. Это позволяет эффективно разрушать такой ампликон урацил-ДНК-гликозилазой и, даже если в образец попадает ампликон снаружи, то он не приводит к ложноположительному результату. При первом прогреве реакционной смеси, когда проводится активация TaqF ДНК-полимеразы и запускается ПЦР, урацил-ДНК-гликозилаза инактивируется и не мешает анализу. Таким образом, влияние контаминации ампликонами на анализ можно минимизировать, но это не магический фермент — сильное загрязнение помещения все равно потребует генеральной уборки.

Также мы предлагаем Bst ДНК-полимеразу для петлевой изотермической амплификации (LAMP), которая заметно быстрее классического количественного ПЦР (ПЦР в реальном времени). В прошлом году широкое применение LAMP для диагностики COVID-19 позволило решить проблему быстрого скрининга пассажиров в аэропортах. Еще есть различные варианты обратных транскриптаз (ревертаз) — они все генетически модифицированные, с повышенной термостабильностью и процессивностью. И конечно, различные виды буферов, оптимальных для отдельных применений.

 Credit: Гентерра

Кто использует вашу продукцию?

Наши ферменты используются везде, где нужны ПЦР, ПЦР в реальном времени и ОТ-ПЦР. В первую очередь это разработчики и производители наборов для диагностики онкологических, наследственных и инфекционных заболеваний, в том числе вызванных РНК-содержащими вирусами, такими как коронавирус. Сейчас активно развивается область диагностики коронавируса при помощи изотермической амплификации, поэтому мы отмечаем рост продаж Bst ДНК-полимеразы.

Мы пробовали наши ферменты для амплификации ДНК и РНК, выделенных из самых разных биологических материалов, и они всегда демонстрировали хорошую эффективность.

В первую очередь нашу продукцию покупают государственные компании — основные производители тест-систем и научные лаборатории. Сейчас это в основном российские компании из Москвы, Санкт-Петербурга и Новосибирска, но есть планы выйти на рынки Узбекистана, Казахстана и Белоруссии.

 Изображение: Александр Челкин, заместитель генерального директора по научной и производственной работе Credit: Гентерра

Александр, расскажите про ваше производство. Как у вас налажен контроль качества?

Наши ферменты представляют собой рекомбинантные белки. У нас есть плазмиды, в которые заклонирован ген нужного нам фермента. После трансформации культуры кишечной палочки E. coli, бактерии сами производят наш фермент. Нам остается только собрать клетки, разрушить их, а потом с помощью методов аффинной и ионообменной хроматографии выделить нужный нам белок. Контроль качества включает анализ чистоты белка и функциональной активности.

Производство находится в Москве, мы проводим входной контроль сырья, регулярное техническое обслуживание оборудования, а все средства измерения проходят ежегодную поверку. Продукт фасуется в стерильных условиях, а при хранении и транспортировке соблюдается температурный режим. Именно применение системы менеджмента качества позволяет получать отличные продукты.

 Credit: Гентерра

Вы предлагаете готовые смеси для ПЦР, в которые нужно добавить только праймер и матрицу? Можно ли кастомизировать такой продукт?

Да, мы предлагаем такие смеси. И для ПЦР с TaqF ДНК-полимеразой, и для ПЦР с обратной транскрипцией. Очень скоро в продаже появятся мастер-миксы для изотермической амплификации. Если у пользователя есть специальные пожелания, мы всегда готовы их учесть, изменить состав наших смесей по запросу. Также мы готовы поставлять отдельные компоненты.

Чаще всего нас просят изменить концентрацию ионов магния в смеси, от них может зависеть эффективность амплификации разных ДНК-мишеней. И если по экспериментальным оценкам у заказчика фермент работает не оптимально, то концентрацию можно варьировать. Также по просьбе клиента мы можем изменить состав, например, добавляя различные детергенты и энхансеры.

Мы всегда готовы предоставить консультацию. Если нет очевидного решения, «Гентерра» может предоставить пробные образцы с различным составом буферов, чтобы пользователь сам мог выбрать оптимальный вариант.

В чем преимущество готовых смесей? При их использовании нет необходимости заводить всю «кухню» по приготовлению растворов, закупке сырья, его входному контролю. Для этого нужно дополнительное оборудование, сотрудники, отдельное помещение — все это требует достаточно больших вложений, поиска квалифицированных сотрудников и так далее. При покупке мастер-миксов клиенту просто требуется только добавить свой образец и праймеры/зонды.

Также мы делаем смеси для последующей лиофилизации. Лиофилизированные смеси чаще всего не требуется хранить при -20⁰C, они достаточно длительное время хранятся при 2–8⁰C и даже при комнатной температуре. Это удобно для логистики, особенно для южных регионов — нет жестких требований к холодовой цепи. При этом обычно вся реакционная смесь уже расфасована по индивидуальным пробиркам, предназначенным для проведения ПЦР, и вы просто добавляете выделенный клинический образец и ставите реакцию. Лаборанту, который проводит исследование, не нужно что-то самому смешивать или «прокапывать». Это значительно ускоряет процесс проведения реакции, а также снижает вероятность ошибок.

Что делать пользователю, если у него все же возникли проблемы с вашей продукцией?

Пользователь всегда может обратиться в «Гентерру», а мы разбираем ситуацию и определяем, в чем проблема. По всей линейке выпущенной продукции у нас хранятся архивные образцы в течение всего времени годности. Мы всегда можем оценить, есть ли проблема с той продукцией, что мы отправили, либо что-то пошло не так из-за неправильного использования или хранения. Всегда есть возможность сравнить продукт с тем образцом, что лежит у нас. И в зависимости от того, какая именно проблема возникла, мы ее решаем различными путями.

Какой у вас объем производства? Хватало ли его в период максимального спроса на реактивы при пандемии? Планируете ли вы расширяться?

Ежемесячно мы производим каждого фермента в количестве, достаточном для постановки 2–3 миллионов реакций. В 2020 году объемы производства возросли — на пике потребления мы ежемесячно производили ферментов на 5 миллионов реакций.

Переходить на более интенсивное производство было тяжело. Если до этого была возможность больше времени уделять внедрению новой продукции, экспериментам по ее адаптации для производства и расширению линейки продуктов, то в период пандемии мы просто отложили все и работали только с теми ферментами, которые необходимы для диагностики коронавируса. И сотрудники уже начали вспоминать «День сурка»: ты приходишь, а у тебя непрерывно — хроматография, хроматография, хроматография… И никакого разнообразия. Но мы справились, ничего не пришлось закупать срочно, тех мощностей, что у нас были, нам хватило, хотя работали уже практически на пределе технологических возможностей.

В настоящее время мы планируем расширение лаборатории, закупаем дополнительные системы для хроматографической очистки ферментов, что позволит нам еще в несколько раз увеличить объемы выпуска продукции.

 Credit: Гентерра

Также мы расширяем линейку продукции. Сейчас у нас в разработке два направления. Идет внедрение новых вариантов Bst-полимеразы для изотермической амплификации. Также на этапе тестирования находится фермент, который обладает одновременно и полимеразной активностью, и ревертазной активностью. Он позволит или использовать только один фермент для проведения амплификации, или же в смеси с ревертазой увеличить ее чувствительность и эффективность.

Наша компания постоянно развивается, появляются новые продукты. Но уже сейчас мы готовы обеспечивать клиентов большими объемами ферментов, буферов и смесей. При необходимости что-то изменить в составе продукта мы всегда идем навстречу. Объемы производства и гибкость — вот наши основные преимущества.

Партнерский материал

Узнать подробности о продукции АО «Гентерра»:

+7 495 7212970

+7 929 6925864

info@genterra.ru