Шухрат Миталипов о генной терапии клеток зародышевой линии

Nature Medicine недавно опубликовал статью, ведущий автор которой — Шухрат Миталипов, эмбриолог с мировым именем, директор Центра эмбриональной и генной терапии (Орегонский университет здравоохранения и науки). В статье дан обзор основных тенденций медицинского генного редактирования зародышевой линии человека, перечислены возможные проблемы и пути их преодоления. Авторы выступают против призывов запретить все связанное с редактированием геномов клеток зародышевой линии человека и предлагают тщательно оценить риски и выгоды тех или иных решений.

Изображение:
Шухрат Миталипов (справа) и Пол Миталипов | Пресс-релиз 

Интерес к редактированию клеток зародышевой линии не ослабевает с ноября 2018 года, после заявления доктора Хэ Цзянькуя о рождении генномодифицированных девочек. «Хотя эта мгновенная реакция (стремление ограничить редактирование человеческого генома. — PCR.news) понятна, более чем в 30 странах, включая Китай, уже существуют нормы и законы, запрещающие генетические модификации зародышевой линии человека (…), — пишут авторы статьи. — Таким образом, неотложной является не введение дополнительных мораторий или запреты, а вопрос о том, как укрепить уже существующие правила во всем мире».

Шухрат Миталипов — признанный эксперт в этой области. Широкую известность получила статья научной группы под его руководством, опубликованная в Nature 2 августа 2017 года. Темой статьи была коррекции доминантной гетерозиготной мутации в гене MYBPC3, вызывающей гипертрофическую кардиомиопатию, в человеческих эмбрионах с помощью CRISPR-Cas9. Авторам удалось достичь высокого выхода гомозиготных эмбрионов и избежать мозаицизма. Среди других достижений Центра эмбриональной и генной терапии — развитие митохондриальной заместительной терапии, то есть замены митохондрий, несущих мутантную мтДНК в ооцитах человека (2012).

Соавторы статьи — Дон Вольф, почетный профессор акушерства и гинекологии в портлендской Школе медицины OHSU, и 17-летний сын Миталипова, Пол, который был волонтером в лаборатории отца. Шухрат пригласил сына помочь с графическими элементами и ссылками, а также поправить текст в нескольких местах. «Я помогал переписывать некоторые разделы, чтобы научный жаргон не мешал обычным людям читать и понимать статью, — сказал Пол. — Для не-ученых важно понять, где сейчас находится редактирование генов зародышевой линии и куда оно может пойти».

Авторы сразу подчеркивают, что генная терапия клеток зародышевой линии имеет огромные перспективы. Известны более 10000 моногенных наследственных заболеваний, от которых страдают сотни миллионов людей по всему миру. Среди них муковисцидоз, болезни Гентингтона, Тея–Сакса, синдром Марфана, бета-талассемия, некоторые наследственные онкологические заболевания. Во многих случаях все возможные варианты лечения чрезвычайно дороги и сложны, и обычно не удается полностью восстановить качество жизни больного.

«Однако в настоящее время разработаны способы коррекции вызывающих заболевания мутаций ядерной и митохондриальной ДНК в гаметах или эмбрионах перед имплантацией, обычно называемые генной терапией клеток зародышевой линии (germline gene therapy, GGT). Мы обсудим эти новые стратегии и предложим путь к безопасной высокоэффективной GGT», — говорится в аннотации.

В некоторых ситуациях можно найти альтернативы генному редактированию, такие как диагностика генетических отклонений у плода в первом триместре беременности или преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) при ЭКО с последующим отбором эмбрионов, не содержащих мутации. Это кажется приемлемым вариантом для пар, в которых один из родителей или даже оба гетерозиготны по мутации. Однако необходимость отбраковывать эмбрионы с мутацией снижает число эмбрионов, пригодных для ЭКО, и, соответственно, эффективность процедуры. К тому же отбраковка эмбрионов или аборты при обнаружении мутации неприемлемы для многих людей по религиозным мотивам. С этой точки зрения редактирование клеток зародышевой линии более этично, к тому же оно подходит для людей, гомозиготных по мутации, желающих, чтобы их дети были здоровыми.

Существует и активно развивается генная терапия соматических клеток. Но многие заболевания, например ту же гипертрофическую кардиомиопатию, болезнь Гентингтона, онкологические заболевания, ассоциированные с BRCA, едва ли возможно остановить с помощью соматической генной терапии. Таким образом, в очень многих случаях альтернативы GGT, по сути, нет

Пути и перспективы

Одним из первых подходов к терапевтическому редактированию генов является вставка дополнительной синтетической копии гена, который у больного поврежден мутацией, в случайное место генома с помощью вирусного вектора. Однако безопасность и эффективность этого подхода, возможно, приемлемы для генной терапии соматических клеток, но недопустимы для GGT.

Другой подход приобрел широкую популярность с появлением систем CRISPR-Cas: внести разрез в районе гена-мишени, с тем, чтобы индуцировать дополнительную мутацию и изменить функцию белка. Такой подход испытали, в частности, на мышиной модели миодистрофии Дюшенна: удаление нонсенс-мутации, ответственной за развитие гена, возобновляло синтез укороченного белка и улучшало состояние животных. Та же идея лежит в основе ВИЧ-профилактики путем редактирования нормального гена CCR5: предполагается, что внесение определенной делеции в этот ген предотвращает взаимодействие ВИЧ с мутантной формой рецептора.

На нынешнем этапе развития CRISPR-технологий невозможно «программировать» специфическую мутацию. Очень часто новые мутации не только не дают желаемого положительного эффекта, но, скорее всего ухудшают положение пациента. В этом одна из причин негативного отношения к экспериментам Хэ Цзянькуя.

Так или иначе, генетических заболеваний, которые можно лечить дополнительным повреждением гена, сравнительно немного. Действительно полезной могла бы быть замена мутантного участка в ДНК нормальным, не содержащим мутации. Какие перспективы имеются в этом направлении?

Особый случай — мутации в митохондриальной ДНК, которую, как и митохондрии, человек получает от матери, в цитоплазме яйцеклетки. Технологии CRISPR в данном случае нельзя использовать: CRISPR-Cas9 только вносит разрез в ДНК, а сшивают его клеточные механизмы репарации и рекомбинации. В митохондриях таких механизмов нет. (Хотя есть обнадеживающие эксперименты на мышах с другими нуклеазами, применяемыми для редактирования ДНК, — ZFN и TALEN.) Но «замену мутантной копии» можно осуществить иным способом — заменив полностью материнские митохондриальные геномы донорскими. Для этого в донорскую яйцеклетку, в цитоплазме которой содержатся митохондрии без мутации в геноме, переносят ядерный генетический материал пациентки и затем проведя оплодотворение, как обычно при ЭКО. Небольшая примесь материнской мтДНК (1–4%) все равно присутствует в ооците, однако ее слишком мало для развития болезни. Фактически митохондриальная заместительная терапия также является GGT, так как целенаправленно изменяется геном зародышевой линии. Такая процедура уже привела к рождению здорового ребенка мужского пола у матери с синдромом Лея; об этом много писали в 2016 году. Сейчас клинические испытания митохондриальной заместительной терапии разрешены только в Великобритании (единственная страна в западном мире и единственная разрешенная технология), в США, где технология впервые была предложена, — нет.

Что касается геномной ДНК — за ее целостность отвечают мощные механизмы рекомбинации и репарации, которые могут не только сшивать разрезы в ДНК, но и заменять поврежденные участки исправленными. В соматических клетках превалирует негомологичное сшивание концов (non-homologous-endjoining, NHEJ), при этом возникают инсерции и делеции. Лишь небольшая часть повреждений восстанавливается за счет гомологичной репарации (homology-directed repair, HDR). В качестве матрицы для такой репарации может использоваться олигонуклеотид, добавленный в клетку вместе с CRISPR-Cas-системой. Понятно, что второй путь предпочтительнее для GGT, поэтому усилия исследователей направлены на то, чтобы подавить NHEJ и активизировать HDR.

В качестве матрицы для восстановления двухцепочечного разрыва, сделанного CRISPR-Cas9 (и для исправления мутации) может также использоваться гомологичная хромосома, с нормальной копией интересующего гена. Этот процесс, для которого «внешняя» матрица не нужна, называется генной конверсией; он может происходить как при мейозе, так и при митозе. В работе по коррекции мутации гена MYBPC3, выполненной под руководством Шухрата Миталипова, 64% репарационных событий произошли по механизму генной конверсии и всего 36% — за счет NHEJ.

Перспективное направление — редактирование оснований. Методы этой группы часто также используют CRISPR, но без разрезания нуклеотидной цепочки; идея в том, что одно азотистое основание превращается в другое. Таким способом можно исправлять точечные мутации. К сожалению, редактирование оснований тоже может быть нецелевым. Есть и другие ограничения — например, на определенном расстоянии от нуклеотида, который нужно заменить, должна находиться PAM — последовательность длиной 2-6 нуклеотидов, необходимая для связывания CRISPR.

Безопасность

От обзора технологий авторы переходят к соображениям безопасности. Первая проблема — конечно, нецелевые (офф-таргетные) мутации в участках, гомологичных мишени. Снизить число таких мутаций может тщательный выбор гидРНК для CRISPR. Здесь может помочь скрининг кандидатных гидРНК с помощью родительской ДНК, соматических и индуцированных плюрипотентных клеток, полученных от родителя с мутацией. Клетки редактируют с использованием кандидатных гидРНК, и затем для них выполняется секвенирование — полногеномное, полноэкзомное или дигеномное (подход, специально разработанный для выявления нецелевых мутаций.) Конечно, скрининг не отменяет необходимости секвенировать клетки эмбриона до имплантации, аналогично тому, как это делается при ПГД.

Причиной нецелевых мутаций могут быть слишком высокие концентрации белка Cas9 в клетке при избыточной экспрессии его гена в плазмиде. Поэтому более безопасным представляется вводить в ооцит или зиготу белок, а не генную конструкцию.

Отдельно следует рассматривать мутации, которые нельзя назвать офф-таргетными, но которые тем не менее опасны — те, что происходят в сайте-мишени, но «незапланированно», как, например, перестройки, инсерции и делеции, вызванные NHEJ. Такие перестройки могут быть достаточно протяженными, их присутствие необходимо контролировать, а снижение частоты репарации по пути NHEJ остается одной из ключевых проблем в обеспечении безопасности. Авторы отмечают перспективный путь — воздействие на клетки белком RAD51, индуцирующим генную конверсию. Недавние исследования на животных показали, что воздействие RAD51 на эмбрионы снижает NHEJ, в то же время увеличивая генную конверсию втрое.

Генная конверсия — замена участка, содержащего мутацию, на немутантный — кажется «хорошим» путем, но и с ней связан некоторый риск: она ведет к потере гетерозиготности. Заменяются достаточно протяженные участки в обоих направлениях от таргетного сайта (десятки т.п.н.), причем даже в отдельных бластомерах одного эмбриона их длина может быть различной. Теоретически при этом может стать гомозиготной «молчащая» мутация, что приведет к развитию другой патологии.

Есть и другая опасность, которую обсуждают сравнительно редко. Клетка реагирует на разрывы в ДНК по сигнальному пути р53 — остановкой клеточного цикла и апоптозом. Редактирование ДНК с внесением разрывов может привести к селекции клеток, дефектных по р53, и, следовательно, к повышенному риску опухолеобразования у человека с отредактированным геномом.

Наконец, еще один фактор риска — возможность мозаицизма: один и тот же участок генома в разных клетках одного и того же эмбриона может быть отредактированным по-разному или неотредактированным. Эта проблема хорошо знакома специалистам по ПГД: анализируется геном трех-пяти клеток эмбриона, и по результатам анализа принимается решение о переносе, тогда как в других клетках ситуация может быть иной. Систему CRISPR-Cas9 вводят в одноклеточный эмбрион (зиготу), но редактирование происходит уже после первых делений, на стадии 2-4 клеток, что и приводит к мозаицизму. Стратегии снижения этого риска — уменьшение времени активности Cas9, введение CRISPR-Cas9 на возможно более ранней стадии, возможно, даже в ооцит одновременно с оплодотворением. Повышение частоты генной конверсии и снижение NHEJ также уменьшает мозаицизм.

Пока еще обсуждается вопрос: как долго следует наблюдать детей с отредактированным геномом, чтобы убедиться, что они совершенно здоровы. Мнения расходятся: от нескольких лет до десятилетий, или даже в следующем поколении.

Запретить или разрешить?

Естественно, авторы не призывают к свободному экспериментированию в этой области. Но стремление запретить всё и сразу тоже не решит проблемы. «Большинство людей, призывающих к запретам, на самом деле не являются экспертами, работающими в области генной терапии зародышевой линии человека или репродуктивной медицины», — говорит Шухрат Миталипов.

Запреты поведут лишь к тому, что семьи из США или Европы, нуждающиеся, например, в митохондриальной заместительной терапии, станут обращаться в клиники в других странах, где медицинские процедуры хуже контролируются, с горечью отмечают авторы статьи.

Более логичным был бы не полный запрет, а разрешение на проведение процедур GGT в академических центрах, достаточно компетентных, чтобы обеспечить контроль, эффективность и безопасность. В частности, Американское общество генетики человека настоятельно рекомендовало выделить государственное финансирование для исследований в области GGT: запреты и остановка финансирования приведут лишь к вытеснению экспериментов в теневую сферу.

Американские национальные академии науки, инженерии и медицины (NASEM) называют следующие критерии, которым должны соответствовать технологии медицинского генного редактирования клеток зародышевой линии, чтобы их клинические испытания получили поддержку: отсутствие альтернативных методов лечения; большая тяжесть заболевания; замена участка генома вариантом, превалирующим в популяции, ассоциированным со здоровьем и без известных побочных эффектов.

А что думают неспециалисты? Авторы приводят данные опроса, в котором участвовало около 1600 взрослых американцев с декабря 2016 по январь 2017 года. Оказалось, что 64% считает приемлемым редактирование генома соматических клеток, 65% — клеток зародышевой линии; 59% поддерживало редактирование геномов в медицинских целях, 33% — в целях изменения или улучшения человеческих способностей.

Резюме: руководящим органам не поддаваться панике и принимать взвешенные решения, исследователям — повышать эффективность и безопасность редактирования, фокусироваться на наиболее вредных моногенных заболеваниях, они же наиболее перспективные для лечения с помощью генного редактирования.


Источник

Don P. Wolf, Paul A. Mitalipov & Shoukhrat M. Mitalipov. // Principles of and strategies for germline gene therapy. // Nature Medicine (2019), DOI: 10.1038/s41591-019-0473-8

Цитаты по пресс-релизу

Добавить в избранное

Вам будет интересно