Тест на коронавирус для России

Диагностика коронавируса SARS-CoV-2 в России вызывает много вопросов. Самый очевидный из них: почему в России так мало зарегистрированных случаев заражения при обширной границе с Китаем и серьезными пассажиропотоками со странами, в которых выявленных случаев заметно больше? По официальной статистике Роспотребнадзора на 12 марта «в Российской Федерации зарегистрировано 28 случаев коронавирусной инфекции, из них 2 у граждан КНР, 25 у граждан России, вернувшихся из Италии, 1 у гражданина Италии». В то же время Роспотребнадзор сообщает, что «на 11.03.2020 проведено 76 963 лабораторных исследований, выполненных центрами гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации, на наличие нового коронавируса в материале от людей, прибывших из стран, неблагополучных по новой коронавирусной инфекции».

Лабораторная диагностика по определению инфицированности пациентов проводится с помощью ПЦР-тестов для выявления РНК коронавируса, основным видом биоматериала для исследования является мазок из носоглотки и/или ротоглотки. С самого начала в России эти анализы проводят исключительно центры гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации, а единственная тест-система, используемая в этих центрах, разработана Государственным научным центром «Вектор» и зарегистрирована Росздравнадзором 11 февраля 2020 года (регистрационный номер — РЗН 2020/9677).

Всего же в реестре медицинских изделий Росздравнадзора на сегодня зарегистрированы три тест-системы для выявления РНК нового коронавируса: две — от ГНЦ «Вектор» (вторая зарегистрирована 14 февраля 2020 года и, по нашим сведениям, является проверочной), а еще одна — от ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Минздрава России (ЦСП). Последняя зарегистрирована только 6 марта и на данный момент не используется.

По нашей информации, на разных стадиях разработки и испытаний находятся тест-системы, создаваемые в компании «ДНК-Технология», Научно-исследовательском институте микробиологии Министерства обороны Российской Федерации (48 ЦНИИ МО РФ) совместно с компанией СИНТОЛ, вероятно — в ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, а также в НИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России (НИЦ им. Н.Ф. Гамалеи).

Основная и пока единственная используемая тест-система в России, как сказано, разработана в ГНЦ «Вектор», именно с ее помощью провели десятки тысяч анализов образцов, полученных от пациентов с подозрением на COVID-19.

Наша редакция направила официальные запросы в Роспотребнадзор и Минздрав, чтобы получить характеристики системы ГНЦ «Вектор», а также информацию по организации работы с другими тест-системами. В пресс-службе Минздрава нам сообщили, что все вопросы по ситуации с коронавирусом комментирует оперативный штаб, а от его имени выступает Роспотребнадзор. Роспотребнадзор, в свою очередь, не ответил в установленный законом семидневный срок, и на момент публикации мы ответа так и не получили. Поэтому мы собрали информацию из нескольких источников. В том числе в распоряжении редакции есть инструкция по применению набора ГНЦ «Вектор».

Набор

Что должен включать набор для выявления РНК коронавируса в образцах? Три компонента: реагенты для экстракции РНК, реагенты для обратной транскрипции, то есть перевода РНК в ДНК, и реагенты для ПЦР. Последний компонент состоит из ферментов, буфера и праймеров — олигонуклеотидов, комплементарных каким-либо последовательностям генома коронавируса.

В наборе «Вектора» есть только этот последний компонент, а для выделения РНК и обратной транскрипции предлагается использовать наборы других производителей. В частности, для выделения РНК вируса предлагают использовать «Рибо-сорб» (ЦНИИЭ, Россия) или аналоги, причем работу на этой стадии нужно проводить в помещении с классом биозащиты BSL-3.

Мы предполагаем, что такая «урезанная» комплектация возникла из-за того, что тест нужно было создать очень быстро, поскольку как-то анализы нужно было проводить. Тем не менее это крайне неудобно для лабораторной диагностики.

Контрольные образцы

Тест-системы такого типа всегда включают положительный и отрицательный контрольные образцы. Они есть в тесте «Вектора»: раствор рекомбинантной плазмиды со вставкой ДНК, комплементарной участку генома коронавируса, и очищенная вода.

Однако обычно тест-системы включают еще и внутренний контрольный образец — молекулу РНК, защищенную от действия нуклеаз, которую при анализе добавляют в образец на первой стадии — стадии выделения, чтобы она вместе с мишенью проходила все этапы лабораторного исследования и в конце дала свой собственный сигнал, который покажет, что на всех этапах все было хорошо.

В тесте «Вектора» такого образца нет, поскольку и сам тест не рассчитан на использование с первой стадии. То есть если что-то пойдет не так в конкретной пробирке, определить ошибку будет нельзя.

Чувствительность

Заявленная чувствительность тест-системы ГНЦ «Вектор» — 10⁵ копий плазмид на миллилитр, содержащих вставки ДНК, комплементарные участку генома коронавируса. Высокая это чувствительность или низкая? По современным меркам — низкая.

Например, наборы, которые выпускаются в России для других РНК-мишеней — вирусов гриппа, норовируса, ротавируса — Центральным НИИ эпидемиологии или компанией «ДНК-технология», имеют чувствительность 10³ на миллилитр. Разница на два порядка. Даже если не учитывать потери при обратной транскрипции (а чувствительность системы, как следует из инструкции, определяется по числу копий ДНК).

У уже зарегистрированного набора ЦСП чувствительность как раз 10³ в мазках со слизистой (так указано в инструкции к набору, которая имеется в распоряжении редакции). По нашей информации, примерно такой же чувствительности добиваются в разработке НИЦ им. Н.Ф. Гамалеи.

И генеральный директор компании «ДНК-технология» Владимир Колин говорит:

«Мы пока не проверяли на реальных образцах, но рассчитываем выйти на чувствительность 10³ на миллилитр».

Наверное, в тех условиях, в которых создавалась система «Вектора» — в России не было клинических образцов от пациентов и штамма коронавируса, а тест необходимо было создавать быстро, — достигнутая чувствительность была приемлемой. Но сейчас, как мы видим, уже есть или разрабатываются более чувствительные наборы.

Чем плоха низкая чувствительность? Возможна ситуация, когда пациент явно инфицирован, но концентрация вируса в пробе у него ниже, чем 10⁵. В этом случае результат тестирования будет отрицательным. Тест не выявит начало заболевания, либо слишком рано будет принято решение о том, что выздоравливающий пациент больше не выделяет вирусы и не может никого инфицировать. А он ходит по улице, и он заразен. (По данным китайских исследователей, выделение вируса может продолжаться до 37 дней.)

Например, по нашей информации, тест «Вектора» выявил у одного из московских пациентов коронавирус только в первый день диагностики, а в следующие дни давал ложноотрицательный результат.

В этом может быть ответ на вопрос, почему в России так мало случаев коронавирусной инфекции. Не исключено, что тест «Вектора» выявляет только верхушку пирамиды — лиц с высокой концентрацией вируса, при этом образцы с концентрациями вирусных геномов 10⁴, 10³ считаются «чистыми». А таких относительно легких случаев может быть немало. В результате официальная статистика может неверно отражать эпидемиологическую обстановку, а принятые меры — не соответствовать реальной угрозе.

Специфичность

С ложноотрицательными результатами теста разобрались. Теперь о ложноположительных срабатываниях, то есть о специфичности. Любой тест может показывать у некоторого числа здоровых людей заболевание. В спокойной обстановке в этом нет ничего страшного, поскольку можно десять раз перепроверить анализы у каждого пациента. Совсем другое дело — ситуация эпидемии. В этом случае диагностика опять выдает управленческим структурам недостоверную информацию о количестве инфицированных, принимается решение о проведении клинических и лечебных мероприятий в отношении пациентов, которые вообще не болеют. Ресурсы здравоохранения направляются на ложные цели.

Инструкция к тесту ГНЦ «Вектор» сообщает, что набор «не должен давать положительных результатов с образцами здоровых доноров или образцами, содержащими генетический материал гетерологичных вирусов (вирус гриппа типа А, аденовирус 5 типа, коронавирус SARS, вирус денге 1)». То есть здесь приведен список тех вирусов, при наличии которых в образце тест на новый коронавирус не должен давать позитивного результата — «кроссов». И здесь у теста все хорошо, специфичность 100%.

Однако это вопрос про праймеры для реакции амплификации. Если праймеры специфичны именно к этому вирусу, то все хорошо, если же праймеры могут отжигаться на нецелевую мишень, то получим ложнопозитивный результат. К сожалению, саму последовательность праймеров многие разработчики — не все — держат в секрете, поэтому редакция не располагает информацией, на гены каких именно белков и на какие участки этих генов они созданы.

С другой стороны, ВОЗ пишет, что в настоящее время известно о циркуляции среди населения четырех сезонных коронавирусов (HCoV-229E, -OC43, -NL63 и -HKU1), которые, как правило, вызывают заболевания верхних дыхательных путей — от легких до средней тяжести. Поэтому испытания теста должны проводиться на как можно более широкой панели, чтобы отсечь ложные срабатывания. Желательно, чтобы образцы были от пациентов, либо в панель должны быть включены вирусы, генетически наиболее близкие этому коронавирусу и достаточно широко распространенные.

У нас нет подтвержденной информации о ложных срабатываниях теста на сезонные коронавирусы, но наши источники сообщали, что нашли тот вариант сезонного вируса HCoV-NL63, который дает положительный сигнал на наборах «Вектора». Ложноположительный. Также, по нашим сведениям, эта информация есть у руководства Роспотребнадзора.

Сколько именно неспецифичных срабатываний дает тест, сказать нельзя, но из общих соображений эксперты называют цифру до 10%.

Сравнивая набор «Вектора» с зарегистрированной системой ЦСП, видим, что панель ЦСП шире.

И Колин также говорит, что «ДНК-технология» намерена отработать тест на широкой панели:

«При разработке праймеров часть из них была разработана на общие участки для коронавирусов SARS-CoV и SARS-CoV-2, а часть на специфичные для SARS-CoV-2. Мы планируем проверить на специфичность на широкой панели».

По тест-системам, разрабатываемым другими группами, у редакции достоверной информации нет.

Применение

Теперь самый болезненный для общества вопрос: какие структуры могут диагностировать коронавирус SARS-CoV-2 в России? И вопрос, который следует из первого: будут ли использованы разработки тех организаций, которые мы перечислили выше?

Согласно «Временным методическим рекомендациям по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции» Минздрава и Роспотребнадзора все образцы «биологических материалов в обязательном порядке направляют в научно-исследовательскую организацию Роспотребнадзора или Центр гигиены и эпидемиологии в субъекте Российской Федерации». То же самое подчеркивается в постановлении главного санитарного врача РФ от 2 марта. А эти организации работают только на наборах ГНЦ «Вектор».

Эти требования жестко увязываются с тем, что новый коронавирус отнесен ко II группе патогенности. В письме Роспотребнадзора «О требованиях к организации лабораторных исследований на новую коронавирусную инфекцию (COVID-19)» от 6 марта 2020 года говорится: «Любые клинико-диагностические и лабораторные работы, связанные с использованием потенциального инфицированного/инфицированного новым коронавирусом (COVID-19) материала, могут проводиться исключительно в лабораториях имеющих лицензию на осуществление деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных II степени потенциальной опасности».

Однако до сих пор работать с патогенами, отнесенными ко II группе, было можно с некоторыми ограничениями и в лабораториях, где разрешена работа c группами только III-IV. Вот цитата из «Постановления Главного государственного санитарного врача РФ от 28 января 2008 г. N 4 "Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08"»:

«2.1.6. Исследования на холеру и ботулинический токсин, выполняемые с целью профилактики холеры и ботулизма, иммунологические (серологические) исследования по обнаружению в крови людей антигенов микроорганизмов II группы патогенности (без накопления возбудителя) и/или антител к ним, ПЦР-исследования (без накопления возбудителя) по детекции в клиническом материале возбудителей бруцеллеза, парентеральных вирусных гепатитов В и С, СПИД и других микроорганизмов II группы патогенности, регламентированные действующими нормативно-методическими документами, могут проводиться в лабораториях, работающих с микроорганизмами III группы патогенности. Иммунологические (серологические) исследования и ПЦР-исследования проводят в боксированном помещении или в боксе биологической безопасности».  

Что это значит? Это значит, что СанПин позволяет работать с вирусами из II группы методом ПЦР в условиях III–IV группы. Так, например, работают по всей стране с ВИЧ, который тоже отнесен ко II группе. В том случае, если опасный патоген не собираются наращивать в культуре или инфицировать им лабораторных животных, а исследуют его генетический материал, пробирку с образцом открывают в ламинарном шкафу и добавляют в нее вещество, разрушающее вирус (например, гуанидинизотиоцианат). После этого фактически речь идет не о вирусе, а о его белках, ДНК или РНК.

Тем не менее сейчас круг лабораторий, которые могут диагностировать инфекцию SARS-CoV-2, ограничен Роспотребнадзором.

Из этих ограничений следует и практически монополия ГНЦ «Вектор» и других структур на образцы и штаммы коронавируса. Сейчас уже можно купить в Европе штамм, и его приобретение было бы важным для разработчиков тест-систем. Формальных запретов на его провоз в Россию нет, но нужно получить разрешение Федеральной службы по техническому и экспортному контролю (ФСТЭК), а та просит санитарно-эпидемиологическое заключение, которое по второй группе выдает опять же лишь Роспотребнадзор. Процесс может тянуться годами.

Еще одно последствие: перепроверить результат анализа сейчас может только ГНЦ «Вектор» (предположительно, с помощью второй тест-системы, информации о которой нет сейчас ни у кого, кроме самого производителя).

Клинические испытания новых тест-систем тоже проводит «Вектор», говорит Колин:

«Это сейчас единственный путь. Только у “Вектора” есть образцы. Не знаю, сколько это займет по времени. Я знаю, что у них ресурса не очень много, и нагрузка для них высокая. Все перепроверки ведь высылаются туда. А вот в Европе запускается программа по созданию наборов по коронавирусу. Чтобы производители могли как-то отвалидироваться, Европа предоставляет панели, которые можно закупить. В Европе есть такая программа, в России нет».

Из общих соображений следует, что для здравоохранения было бы только хорошо, если бы характеристики системы ГНЦ «Вектор» изучили в других лабораториях, работающих с вирусами. Например, в США изначально наборы для выявления коронавируса разработали в Центрах по контролю и профилактике заболеваний (CDC) — американском аналоге медицинской части Роспотребнадзора. И их поставили в различные лаборатории страны. Довольно быстро выяснилось, что один из компонентов системы работает неадекватно и, вероятно, его придется заменить. В конце концов 29 февраля FDA выпустило новое руководство, которое позволяет коммерческим, академическим и правительственным лабораториям самостоятельно разрабатывать и использовать тесты для выявления SARS-CoV-2.

Понятно, что если коммерческие лаборатории в России захотят проводить тестирование на SARS-CoV-2, то они смогут воспользоваться любой тест-системой, которая получит регистрационное удостоверение. Однако неясно, как в этом случае будет выстраиваться взаимодействие с системой Роспотребнадзора.

Масштабирование производства

«Можно создать набор с самыми лучшими характеристиками, но при его производстве в больших количествах нужно обеспечить стабильность, стандартизацию, — говорит Колин. — Я не могу на сто процентов утверждать, не зная производства “Вектора”, но могу предположить, что у них скорее всего не крупносерийное производство, а мелкосерийное. А для меня понятно, что компании с хорошим производством будут стабильнее производить наборы в больших количествах, чем мелкосерийные. Там много всяких факторов возникает, тот же самый менеджмент качества — ISO менеджмента качества 13485, который у нас есть… Я сейчас еще в некотором другом статусе говорю, как председатель Ассоциации российских производителей средств клинической лабораторной диагностики… Как у нас государство работает в кризисной ситуации, какие тут правила работы, как государство использует ресурсы, которые существуют в стране? Есть три действительно крупных производителя, в масштабах даже Европы и мира: ЦНИИЭ Роспотребнадзора, «Вектор-Бест» (они, кстати, тест не делают пока) и мы. И вот казалось бы, в стране можно было бы использовать ресурсы крупных производителей. Но почему-то пошли по другому пути. Мне кажется, что он не совсем оптимальный».

Отсутствие конкуренции — это рай?

Когда в мире произошла вспышка атипичной пневмонии, в 2003 году четыре организации в России разработали ПЦР-тесты на выявление возбудителя — коронавируса SARS-CoV. Роспотребнадзор издал приказ о сравнительных испытаниях. Был очень быстро получен вирус, и все разработчики могли испытывать на нем свои системы. Сравнительные испытания проводились в 48 ЦНИИ МО РФ, панели контрольных образцов были зашифрованы. Затем результаты всех тестов вскрыли и сравнили.

Довольно большая разница с тем, что происходит сейчас, не так ли?

Все наши источники сходятся в том, что нужно дать возможность работать с клиническим материалом и применять свои тест-системы и государственным и коммерческим игрокам этого рынка. Но сейчас в условиях распространяющейся эпидемии только структуры Роспотребнадзора (и то не все) имеют эксклюзивное право на получение всех федеральных денег по этой тематике на исследования, разработку вакцин и тестирование препаратов, диагностику всех инфекционных материалов в сети своих организаций.

Информация

Как мы написали выше, мы не получили ответа от Роспотребнадзора на наш официальный запрос на информацию. В таком же положении находятся все СМИ в стране. Но мы открыты к сотрудничеству и с удовольствием опубликуем ответы на наши вопросы. Предварительно проверив, разумеется.

Продолжение темы на PCR.news