Воскресное чтение. Обзор научной периодики за 19–25 октября (без коронавируса)

Новые экспериментальные методы

1. В Nature Biotechnology ученые из MIT и Института Бродов  описали метод для определения возраста молекулы РНК с точностью до часа. Они разработали инструмент редактирования РНК, который с течением времени накапливает повреждения в молекулах РНК. В результате при помощи РНК-секвенирования стало возможно узнать, не только какие гены экспрессируются в клетке, но и когда началась их экспрессия. Такой подход ученые назвали временны́ми метками РНК. Для создания временных меток они помечают РНК репортерным мотивом, состоящим из множества сайтов связывания фага MS2. К этим сайтам присоединяется аденозиндезаминаза ADAR2, слитая с капсидным белком MS2. В результате происходит редактирование азотистых оснований, и аденозин заменяется на инозин. Таких замен с течением времени становится все больше, что позволяет определять возраст РНК с точностью до часа. Исследователи применили этот метод для кластеризации отдельных клеток по их транскрипционной активности в прошлом. (Подробнее на PCR.news.)

Медицинская геномика

2. В Nature опубликованы результаты секвенирования экзомов, проведенного в рамках проекта UK Biobank. В исследовании принимало участие почти 50 тысяч человек, и благодаря большому количеству испытуемых ученым удалось увидеть примеры вариантов генов с потерей функции (Loss-of-Function Variants, LOF) примерно для 97% белок-кодирующих генов. Таким образом, проанализирован вклад в развитие заболеваний почти 198 300 специфических аутосомных вариантов. Ученые обнаружили новые связи между LOF различных генов и распространенными заболеваниями и состояниями: PIEZO1 и варикозным расширением вен, COL6A1 и сопротивлением роговицы, MEPE и плотностью костей, IQGAP2 и GMPR и анализами крови. Кроме того, они охарактеризовали пенетрантность рака у носителей патогенных вариантов BRCA1 и BRCA2. Последовательности экзома от первых участников UK Biobank теперь доступны для научного сообщества.

Диагностика

3. Ученые из Университета Мичигана предложили при помощи жидкой биопсии наблюдать за ответом глиомы на лечение у детей. Жидкая биопсия позволяет проводить онкодиагностику по ДНК раковых клеток, циркулирующей в крови. Однако в случае рака мозга такой подход затруднен из-за гематоэнцефалического барьера. Для таких целей используют секвенирование ДНК из цереброспинальной жидкости, причем, по мнению авторов работы, нанопоровое секвенирование улучшит скорость и предел обнаружения по сравнению с известными методами. Определение внеклеточной опухолевой ДНК из спинномозговой жидкости с помощью секвенатора от Oxford Nanopore Technology показало свою эффективность в клинических испытаниях. Было продемонстрирована корреляция результатов секвенирования с радиологическим ответом 127 пациентов.

4. В журнале Clinical Cancer Research опубликован протокол метода выявления устойчивого к химиотерапии рака поджелудочной железы при помощи нового биомаркера. Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) очень устойчива к системной химиотерапии, но ранее не было найдено маркеров для идентификации этого заболевания. Ученые предположили, что для этой цели можно использовать гликановый биомаркер sTRA. Профессор Брайан Хааб уже публиковал в 2019 году статью про использование нового биомаркера sTRA для идентификации PDAC совместно с уже используемыми тест-системами. Теперь он исследовал потенциал sTRA для применения в клинике отдельно от других маркеров. Выяснилось, что клеточные культуры, продуцирующие sTRA, устойчивы к семи разным препаратам для химиотерапии, а пациенты, в крови которых был обнаружен sTRA, не показали улучшения после терапии.

5. Разработан тест для обнаружения интерлейкина-6 (IL-6) в крови и плазме при помощи иммунофлюоресценции. Этот цитокин играет важную роль в протекании инфекционных заболеваний, и в частности, у пациентов с коронавирусной инфекцией он служит маркером стадии и тяжести болезни. Количественное измерение IL-6 осложняется тем, что его в крови очень мало. Существующие технологии недостаточно точны и чувствительны для измерения его концентраций. Ученые из университета Макмастера (Канада) придумали, как использовать так называемые умные поверхности для повышения точности теста. Покрытие такой поверхности не допускает неспецифической адгезии других компонентов крови из-за специальной смазки, но с большой эффективностью связывает IL-6. Чувствительность метода повышает также особая технология прикрепления антител к подложке. Это позволяет измерять концентрации IL-6 от 0,5 пикограмма на миллилитр. Статья опубликована в журнале Small.

Структурная биология

6. Метод криоэлектронной микроскопии позволил получить структуру белка с атомарным разрешением. В Nature опубликована статья с описанием методики. Авторы использовали технологию холодной автоэмиссионной пушки, которая генерирует электроны с узким энергетическим разбросом, вместе с другой технологией, которая снижает уровень шума на каждом изображении. Захват данных производится с помощью высокочувствительной камеры нового поколения для обнаружения электронов. Исследователям удалось достичь разрешения в 1,7 Å для человеческого мембранного рецептора β3-ГАМК-А3. Также они реконструировали апоферритин мыши с разрешением 1,22 Å.

Миодистрофия

7. Исследователи из Университета Калифорнии (Лос-Анджелес)  нашли вещество, которое действует на мышечные клетки мышей так же, как физические упражнения. Генетический дефект, ответственный за мышечную дистрофию конечностей, вызывает нехватку фермента кальмодулинкиназы в мышечных клетках. Ученые провели высокопроизводительный скрининг мишени CaMKII (кальмодулинкиназа 2, или Myl2), чтобы идентифицировать соединения, которые могли бы увеличивать передачу сигналов от нее. Они проверили более 2000 соединений на культурах мышечных клетках, и 14 перспективных соединений были протестированы in vivo на мышиной модели миодистрофии конечностей, вызванной нокаутом гена Capn3. Соединение AMBMP оказалось наиболее эффективным: оно активировало передачу сигналов CaMKIIβ, но не влияло на другие сигнальные пути, связанные с ростом мышц. Этот результат предоставляет новый подход к разработке препарата для лечения миодистрофии.

Рассеянный склероз

8. Исследователи из Университета Цюриха опубликовали статью в Cell, где описали, каким образом генетическая предрасположенность способствует развитию рассеянного склероза в сочетании с факторами окружающей среды. Уже почти 50 лет известно, что вариант гена HLA-DR15 сильно связан с рассеянным склерозом (РС). Если носители этого варианта (то есть около четверти здорового населения) также инфицированы вирусом Эпштейна–Барр и болели инфекционным мононуклеозом, то риск РС увеличивается в 15 раз. Молекулы HLA-DR15 находятся на поверхности лейкоцитов, там они презентируют фрагменты белков бактерий и вирусов Т-лимфоцитам. Чтобы узнать роль HLA-DR15, исследователи при помощи масс-спектрометрии охарактеризовали иммунопептидомы двух алломорфов HLA-DR15 (DR2a и DR2b) на поверхности B-клеток и моноцитов человека, а также в тимусе и ткани головного мозга больных с рассеянным склерозом. Им удалось идентифицировать аутореактивные клоны CD4+ Т-клеток, которые могут перекрестно реагировать с пептидами, производными от HLA-DR, пептидами вируса Эпштейна–Барр и аутоантигенами, представленными на DR2a и DR2b.

Онкология

9. Разработан новый метод для детекции опухольспецифичных Т-клеток. Повторная активация и клональная экспансия Т-клеток, несущих опухольспецифический антиген (TSA), — ключевая стадия терапии на основе опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL). Из-за гетерогенности TSA-реактивных Т-клеток не существует надежных маркеров для их специфической изоляции. Новый метод выделения таких клеток называется FucoID, в честь фермента фукозилтрансферазы, который играет главную роль в «маркировке» поверхности иммунных клеток. Фермент помещается в дендритные клетки, которые предъявляют опухолеспецифические антигены клеткам, борющимся с опухолью. При этом взаимодействии фукозилтрансфераза метит Т-клетки, в результате ученые могут обнаруживать их с помощью флуоресцентного зонда и извлекать. В экспериментах на мышах этот подход успешно идентифицировал несколько типов опухолевых антигенспецифичных Т-клеток, включая CD4+ и CD8+ Т-клетки. По сообщению авторов статьи, процесс выделения клеток с помощью FucoID занимает всего один день. Возможно, это ускорит темпы индивидуального лечения рака.

Нейродегенеративные заболевания

10. Согласно статье ученых из Университета Вашингтона (Сиэтл), способствовать риску болезни Альцгеймера могут не только вариации в гене APOE, но и некоторые некодирующие варианты в области этого гена. О связи между болезнью Альцгеймера и генетическими вариациями в гене алипопротеина E (APOE) известно давно. Некоторые предыдущие исследования показали, что две некодирующие однонуклеотидные вариации, одна в TOMM40 и одна в APOC1, также могут быть связаны с риском заболевания или ассоциированными симптомами. Почти 19000 человек приняли участие в исследовании генетики болезни Альцгеймера. Исследователи обнаружили связь между вариантом rs2075650 в гене TOMM40 и риском болезни Альцгеймера среди гомозигот ε4, а также между двумя новыми вариантами и риском заболевания. Другими словами, ученые доказали, что аллели ε2/ε3/ε4 не единственные варианты в области APOE, связанные с болезнью Альцгеймера; некодирующие варианты в области этого гена тоже необходимо учитывать.

Генная терапия

11. Синдром Ангельмана — тяжелое нарушение развития нервной системы, не поддающееся лечению. Оно развивается из-за дефекта в материнской копии гена UBE3A, кодирующего убиквитин-лигазу E3A, в результате чего нарушаются процессы деградации ненужных белков во всей нервной системе. Авторы работы, опубликованной в Nature, продемонстрировали, что методы редактирования генома и генной терапии могут использоваться для восстановления UBE3A в культурах нейронов человека и на животной модели синдрома Ангельмана. Исследователи использовали CRISPR-Cas9, чтобы восстановить функцию фермента до нормы путем разрушения антисмысловой РНК UBE3A-ATS, снижающей экспрессию отцовской копии гена. ( Подробнее на PCR.news.)

12. Генная терапия восстановила зрение у мышей с наследственным заболеванием сетчатки. В журнале Nature Biomedical Engineering вышла статья, в которой описывается применение редакторов оснований для исправления патогенной мутации в гене Rpe65, вызывающей пигментный ретинит и амавроз Лебера. Взрослым мышам ввели под сетчатку вектор на основе аденоассиоциированного вируса, который экспрессировал редактор аденина (ABE) и гидовую РНК, нацеленную на нонсенс-мутацию в гене Rpe65. Исправление патогенной мутации произошло с эффективностью до 29% и с минимальным образованием офф-таргетных мутаций, несмотря на отсутствие канонической PAM-последовательности NGG. Редакторы оснований цитозина (CBE) и редакторы оснований аденина (ABE) могут исправлять точечные мутации без двухцепочечных разрывов ДНК и гомологической репарации, в отличие от Cas9, что говорит о большей надежности и безопасности метода. После редактирования генома у мышей восстанавливалась экспрессия RPE65 и активность ретиноид-изомеразы, а также приходила в норму функция сетчатки.

13. Другой подход к лечению заболеваний сетчатки при помощи генной терапии предполагает использование аденоассоциированного вируса для доставки гена. кодирующего синтетический белок. Ученые разработали новый светочувствительный белок, опсин MCO1, который при адресной доставке при помощи AAV2 в биполярные клетки сетчатки поможет вернуть зрение людям с дегенерацией сетчатки. При множестве глазных заболеваний, в том числе возрастной дегенерации желтого пятна и пигментном ретините, ухудшение зрения происходит из-за повреждения фоторецепторов. В то же время другие нейроны сетчатки, включая биполярные клетки, остаются здоровыми. Исследователи придумали, как можно переложить работу фоторецепторов на биполярные клетки. Они расположены дальше по пути передвижения сигнала от фоторецепторов, поэтому, когда ген опсина MCO1 экспрессируется в биполярных клетках, светочувствительность сетчатки восстанавливается. Пока неизвестно, насколько эффективной окажется терапия у людей и как восстановленное зрение будет сосуществовать с нормальным зрением. Тем не менее такой подход может стать альтернативой протезированию сетчатки для людей с пигментным ретинитом на поздней стадии. Статья опубликована в журнале Gene Therapy.

Новости индустрии

14. Стартап SparingVision, занимающийся генной терапией глазных болезней, объявил о получении финансирования в размере 44,5 млн евро. Инвестиции позволят вывести на рынок инновационный препарат SparingVision SPVN06 против пигментного ретинита. SPVN06 — продукт для генной терапии при помощи аденоассоциированных вирусов, содержащих нейротрофический фактор и фермент, снижающий окислительный стресс. Действуя совместно, белки замедляют или останавливают дегенерацию фоторецепторов на сетчатке. Пигментный ретинит приводит к слепоте; этим заболеванием страдают два миллиона пациентов во всем мире. Поскольку SPVN06 не нацелен на конкретные мутации, он подходит для всех пациентов с пигментным ретинитом. Финансирование будет использовано для поддержания деятельности SparingVision в области GMP (включая производство первой клинической партии продукта), деятельности по регистрации и проведению клинического исследования, которое планируется начать в 2021 году.