Бактериофаг сам запускает защитную реакцию бактериальной клетки

При заражении фагами бактериальные клетки синтезируют циклические олигонуклеотиды для запуска иммунного ответа. Такие системы антифаговой сигнализации носят название CBASS (cyclic oligonucleotide-based antiphage signalling systems) и эволюционно родственны системе cGAS-STING у человека. Авторы статьи в Science показали, что в активации CBASS на поздних стадиях инфекции участвует протеаза самого фага.

Чтобы выявить факторы, распознаваемые антифаговой системой CBASS, авторы смоделировали активацию ее ключевого компонента — cGAS/DncV-подобной нуклеотидилтрансферазы (CD-NTase) — на кишечной палочке и ее бактериофаге Т4. Фаг T4 кодирует белки Acb, защищающие его от бактериального иммунитета — они нарушают передачу сигналов, необходимых для работы CBASS. Вариант этого фага, лишенный функциональных Acb1 и Acb2 (Δacb1/Δacb2), подавлялся защитным опероном CBASS Escherichia coli, а мутации в его генах восстанавливали репликацию фага.

Затем ученые получили растворимые лизаты бактериальных клеток, инфицированных мутантным фагом Т4 Δacb1/Δacb2, и смешали их с лизатом клеток E. coli, которые содержали CBASS с инактивированной эффекторной ДНКазой EcCap5. Активацию CD-NTase в такой системе отслеживали с помощью самостоятельно разработанного биосенсора на основе EcCap5. Оказалось, что синтез 3′2′-cGAMP происходит только в присутствии лизатов инфицированных клеток. Дальнейший анализ временной динамики указывал на то, что для активации CBASS требуется некий растворимый фактор, который появляется в системе на поздних стадиях фаговой инфекции.

Инфицирование E. coli фагом T4 протекает по строгой схеме молекулярных событий, включающей прекращение экспрессии генов хозяина, затем репликацию генома фага и, наконец, формирование новых вирионов на поздних стадиях инфекции. В ходе образования вирионов Т4 субъединицы капсида образуют структуру, называемую проголовкой. Ее процессирует протеаза gp21, в результате чего формируется зрелый капсид. При помощи скрининга фрагментов генома ученые установили, что gp21 необходимо и достаточно для запуска CBASS, причем требовалась именно протеолитически активная форма этого фермента.

Затем исследователи предсказали структуру cGAS/DncV-подобной нуклеотидилтрансферазы E. coli (EcCdnG) с помощью AlphaFold3 и сравнили ее с экспериментально установленными структурами ферментов того же семейства. Они обнаружили в центре структуры неупорядоченную петлю длиной около 30 аминокислотных остатков; ее расщепление должно приводить к образованию продукта с молекулярной массой около 28 кДа. Авторы предположили, что петля представляет собой поверхностную систему активации фермента, позволяя детектировать активность фаговых протеаз. 

Филогенетический анализ выявил такие петли у ряда cGAS/DncV-подобных нуклеотидилтрансфераз. Семь из девяти белков, для которых ученые предсказали наличие активационной петли, запускали синтез циклических олигонуклеотидов в ответ на обработку протеиназой К. В то же время все три проанализированных фермента, не имевшие предсказанных петель активации, не реагировали на обработку протеазой.

Таким образом, система CBASS напрямую распознает активность фаговых протеаз. Активация ключевого фермента фаговым белком gp21 объясняет запуск бактериального иммунного ответа на поздних стадиях инфекции. 

Вирусная РНК активирует у бактерий аналог пути cGAS