CRISPR-тест для диагностики туберкулеза выявляет инфекцию за 15 минут

Ежегодно выявляют около 10 миллионов новых случаев туберкулеза, еще 1,6 миллиона пациентов погибает. При этом более 35% случаев заболевания в странах с низким и средним уровнем дохода остаются недиагностированными из-за ограниченного доступа к современным молекулярным тестам. Традиционные методы диагностики часто требуют дорогостоящего оборудования и сложной инфраструктуры, что делает их практически недоступными там, где они нужны больше всего.

Считаются перспективными тесты на основе технологии CRISPR, однако их клиническое применение сопряжено с определенными трудностями, такими как сложность рабочего процесса и необходимость в высокой концентрации патогена, которой зачастую нет в образцах, взятых у пациентов с туберкулезом. Учитывая эти ограничения, исследователи из Китая и США поставили задачу разработать простую, высокочувствительную и специфичную диагностическую платформу, которая могла бы работать с легко доступными образцами и не требовала бы использования сложного оборудования.

Авторы разработали одностадийный CRISPR-тест для диагностики туберкулеза — ActCRISPR-TB. Этот метод объединяет амплификацию и детекцию ДНК в одной пробирке, что снижает риск контаминации и упрощает процесс по сравнению с двухстадийными системами. Ранее подобные тесты сталкивались с проблемой подавления сигнала из-за цис-расщепления ампликона ферментом Cas12a. Чтобы решить эту задачу, авторы изучили последовательности элемента IS6110, специфичного для M. tuberculosis, и выявили уникальные неканонические гидРНК.

Оказалось, что некоторые гидРНК обладают асимметричной активностью: они хуже активируют цис-расщепление целевого ампликона ферментом Cas12a, но вызывают высокую транс-расщепляющую активность в отношении флуоресцентного репортера. Это способствует накоплению ампликонов и усилению сигнала. Для улучшения работы теста были подобраны оптимальные концентрации праймеров, магния и рибонуклеопротеиновых комплексов (RNP), а также температурные условия. Тест показал стабильную работу при 36-40 °C и совместимость с реагентами разных производителей.

Чтобы еще больше усилить сигнал, ученые предложили использовать несколько RNP, нацеленных на разные участки ампликона. Комбинирование гидРНК-5 с другими гидРНК значительно улучшило чувствительность теста. Эта версия ActCRISPR-TB достигла предела обнаружения в 5 копий/мкл, что в 20 раз чувствительнее аналогичных одностадийных тестов с канонической гидРНК-0, сохранив при этом высокую специфичность к M. tuberculosis.

Испытания ActCRISPR-TB проводились на 603 образцах от 479 пациентов. При анализе мокроты чувствительность составила 93%, а специфичность — 100%, причем 85% положительных результатов были получены уже через 15 минут. У пациентов с ВИЧ, у которых диагностика затруднена, тест достиг чувствительности 80%, что значительно превышает 40% у GeneXpert MTB/RIF Ultra (Xpert, коммерческий тест для диагностики туберкулеза).

В образцах бронхоальвеолярного лаважа ActCRISPR-TB выявил 96% случаев туберкулеза, показав общую согласованность с Xpert 93%. Тест также успешно применялся для анализа кала у детей (чувствительность 83% и специфичность 94%), что лучше, чем у Xpert.

При диагностике внелегочного туберкулеза, например, туберкулезного менингита, тест выявил 93% микробиологически подтвержденных случаев с общей чувствительностью 81%, что значительно выше 35% у Xpert. Одним из ключевых достижений стало использование мазков с языка, которые легко собирать и использовать для массового скрининга. ActCRISPR-TB показал чувствительность 74% (против 56% у Xpert Ultra) и специфичность 100%, обнаружив 33% случаев, пропущенных при анализе мазков мокроты, и 14% случаев, пропущенных Xpert.

Для повышения доступности тест был адаптирован в формат латерального проточного анализа (LFA), который не требует сложного оборудования. Результаты интерпретируются визуально или с помощью смартфона. LFA-версия сохранила высокую чувствительность и специфичность, успешно выявляя туберкулез в 17 из 24 случаев с использованием мазков с языка. Даже слабые сигналы были четко видны через 45–90 минут.

Тест ActCRISPR-TB сочетает высокую чувствительность, специфичность и скорость, позволяя выявлять заболевание за 15–45 минут. Его особенность — это возможность использования мазков с языка, которые легко отобрать самостоятельно, и интерпретации результатов через LFA-полоски или смартфон. Это делает тест доступным для массового скрининга и децентрализованного применения.

CRISPR-тест быстро и экономично выявляет туберкулез в мокроте с точностью до 100%