Два белковых комплекса стабилизируют длину теломер

Помимо инициации и удлинения ДНК при репликации комплекс PP, в состав которого входят праймазы Pri1 и Pri2 и ДНК-полимераза, отвечает за достраивание второй цепи на теломерных участках. Этот процесс проходит при участии комплекса CST, состоящего из субъединиц CTC1-STN1-TEN1 у многоклеточных животных и растений или Cdc13-Stn1-Ten1 у почкующихся дрожжей). Известно, что мутации в субъединицах CST приводят к неконтролируемой элонгации теломер и к образованию одноцепочечных теломерных участков. Исследователи из США с коллабораторами из Испании детально изучили молекулярные механизмы, лежащие в основе регуляции комплекса CST-PP в клетках почкующихся дрожжей Candida glabrata.

Для начала, внося точечные мутации в разные субъединицы комплексов CST и PP, ученые выявили ключевые сайты, отвечающие за активацию PP. Выяснилось, что в субъединице Тen1 ключевую роль играет петля L34, связывающая два β-тяжа и способная вклиниваться между Pri1 и Pri2, регулируя контакт между комплексами.

Моделирование взаимодействий при помощи AlphaFold 3 показало, что несмотря на различия в первичных последовательностях, петля L34 обеспечивает ключевой контакт как между субъединицами Ten1, Pri1 и Pri2 у дрожжей, так и между человеческими ортологами. Поэтому результаты, полученные на Candida glabrata, можно экстраполировать на человека.

Два мутантных варианта — Ten1^L34A и Ten1^L34B — гиперэкспрессировали в клетках дрожжей под контролем сильного промотора PDC1. Они оба были способны включаться в комплексы CST, как и белки дикого типа, но не могли нормально регулировать активацию PP. За несколько поколений Ten1^L34A приводил к постепенному удлинению теломер, которое стабилизировалось примерно на 3,0 тысячах пар нуклеотидов (в штамме дикого типа их средняя длина около 1,2 т.п.н.), тогда как Ten1^L34B способствовал их гетерогенности, нестабильности и в целом замедлял рост клеток.

Гиперэкспрессия Ten1^L34A вызывала удлинение теломер за счет нарушенного подавления теломеразы. Это подтвердилось тем, что в клетках без теломеразы (tertΔ) удлинения теломер не происходило, несмотря на наличие Ten1^L34A. Более того, tertΔ-клетки с Ten1^L34A быстро входили в сенесценцию, несмотря на нормальную длину теломер, что указывает на частичное раскрытие укороченных теломер и, следовательно, потерю их защиты. Однако, если Ten1^L34A экспрессировался в tertΔ-клетках с исходно удлиненными теломерами, ускоренной сенесценции не наблюдалась.

Ко-иммунопреципитация (co-IP) и иммунопреципитация хроматина (ChIP) показали, что мутация Ten1^L34A не нарушает ни взаимодействие между комплексами CST и PP, ни их локализацию на теломерах. Следовательно, теломерные дефекты при данной мутации связаны с нарушением специфической конформации комплекса CST-PP-ДНК.

Дальнейшие опыты показали, что вариант Ten1^L34B нарушает защиту теломер, вызывая активацию ответа на повреждение ДНК и аномальную репарацию. Дефекты, вызванные этим вариантом, заключались в гетерогенности теломер, а также накоплении их одноцепочечных участков и C-кругов — фрагментов внехромосомной теломерной ДНК. При этом они не зависели от работы теломеразы, а мутации ten1^L34B и tertΔ были синтетически летальными — их сочетание приводило к нежизнеспособности всех колоний.

Для установления вовлеченных факторов ответа на повреждение ДНК авторы делетировали ключевые белки — RAD52, RAD24 и EXO1, — а Ten1^L34B экспрессировали под более слабыми промоторами (HHT2 или EGD2), чтобы снизить уровень этого варианта в клетках дрожжей. Делеция EXO1 улучшала рост клеток, ослабляя вредный эффект Ten1^L34B. Все три делеции снижали уровни C-кругов, но по-разному влияли на другие теломерные нарушения, подтверждая участие нескольких путей репарации в ответе на поврежденные теломеры в клетках ten1^L34B.

Мутации в ДНК-связывающей субъединице — Stn1 — нарушали способность комплекса CST стимулировать активность PP, что подтверждает важность этого контакта для формирования целостного комплекса. Хотя аффинность Stn1 к ДНК низка, эта субъединица, вероятно, направляет ДНК к активному центру праймазы. В клетках дрожжей гиперэкспрессия мутантной Stn1 активировала ответ на повреждение ДНК и нарушала репарацию. Как и в случае Ten1^L34B, делеции факторов RAD52, RAD24 и EXO1 смягчали теломерные дефекты при мутации в Stn1, что указывает на наличие схожего механизма.

Полученные данные позволят лучше понять нарушения биологии теломер. Вмешательство в активность белков комплекса CST может замедлить рост раковых клеток, регулируя длину теломер или их защищенность, а также ослабить устойчивость к некоторым противораковым препаратам.

Теломерные последовательности внутри хромосомы — источник геномной нестабильности