Раскрыт механизм влияния однонуклеотидной замены в гене TLR4 на его активность

Экспрессия генов — сложно регулируемый процесс, и нарушение регуляции приводит к возникновению различных заболеваний. Среди прочих факторов, на экспрессию генов могут влиять однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). Исследователи из Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН установили, что полиморфизм rs7873784 в 3’-нетранслируемой области (3'-UTR) гена TLR4 усиливает его экспрессию. Авторы предположили, что участок, содержащий этот SNP, обладает свойствами энхансера (усилителя активности гена). Для проверки этой гипотезы были созданы репортерные конструкции: под промотор гена TLR4 поместили ген люциферазы, после которого следовал изучаемый 3'-UTR TLR4 с точечными мутациями rs7873784 и окружающей области. Этими векторами трансфицировали различные клеточные линии, а затем измеряли люциферазную активность. Конструкция, содержащая минорный С-аллель rs7873784, показала значимое усиление экспрессии гена.

Биоинформатический анализ предсказал, что транскрипционный фактор PU.1 — один из главных стимуляторов экспрессии TLR4 — должен связываться с областью, содержащей минорный С-аллель rs7873784 в 10 раз эффективнее, чем с вариантом, включающим более распространенный G-аллель. И действительно, такое предсказание было подтверждено экспериментально с помощью связывания фрагментов ДНК, содержащих разные варианты rs7873784, антителами к PU.1 и последующего проведения ПЦР в реальном времени. Для дополнительного подтверждения гипотезы о том, что регуляторный эффект rs7873784 на транскрипцию TLR4 опосредован изменением связывания PU.1, авторы провели нокдаун PU.1 в клетках с помощью малых интерферирующих РНК. Полученные результаты подтвердили, что минорный аллель rs7873784(C) может усиливать энхансерные свойства 3'-UTR гена TLR4 за счет эффективного связывания фактора транскрипции PU.1.

На вопросы PCR.news отвечает кандидат биологических наук Кирилл Корнеев, первый автор статьи.

Какое развитие темы вашего исследования вы предполагаете?

На следующем этапе потребуется анализ экспрессии TLR4 в первичных клеточных культурах от пациентов. Кроме того, в рамках деятельности вновь созданного Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, с помощью системы CRISPR/Cas мы можем внести гомозиготные аллельные варианты rs7873784 в геном релевантных клеточных линий, после чего определить влияние аллелей SNP на экспрессию генов иммунной системы.

Подвержены ли каким-либо рискам носители С-аллеля rs7873784?

Исследования по полногеномному поиску ассоциаций (GWAS) выявили значимую корреляцию между полиморфизмом rs7873784 и развитием заболеваний с сильным воспалительным компонентом, таких как ревматоидный артрит, сахарный диабет 2-го типа, туберкулез, периодонтит, некоторые опухоли. В нашей работе мы предложили молекулярный механизм, объясняющий, как C-аллель rs7873784 может способствовать повышению общего уровня воспаления и прогрессии патологий, однако сложно сказать, существует ли здесь непосредственная причинно-следственная связь. Вряд ли здоровым носителям С-аллеля rs7873784 следует предпринимать какие-то активные действия помимо стандартных усилий по поддержанию здорового образа жизни. Однако не исключено, что для людей, находящихся в группе риска, понимание механизмов патогенного действия подобных SNP поможет разработке персонифицированных подходов к лечению путем обнаружения новых кандидатов для молекулярно-таргетной терапии.

Вы нашли энхансерную область с помощью биоинформатических методов. Как вы считаете, способен ли биоинформатический анализ генетических структур вытеснить экспериментальную «мокрую» биологию в будущем?

Давайте будем отталкиваться от того, что биоинформатические методы работают преимущественно с экспериментальными данными. «Мокрая» биология за десятилетия активного развития накопила колоссальное количество информации (и продолжает ее добывать), в то время как компьютерный анализ позволяет, во-первых, интерпретировать и систематизировать «сырые» данные, а во-вторых, делать предсказания на основе уже установленных фактов. В работе мы использовали биоинформатический алгоритм, разработанный коллегами из Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, и это существенно упростило поиск транскрипционного фактора, связывающегося с областью, содержащей полиморфизм. Можно ли было обойтись без компьютерного моделирования и отыскать фактор транскрипции путем примитивного перебора? Да, это возможно, но нецелесообразно — на такой подход пришлось бы потратить много реактивов и человеко-часов. Алгоритм позволил сузить круг потенциальных мишеней.

Очевидно, что полное вытеснение экспериментальной биологии не грозит — даже самые вероятные предсказания нуждаются в проверке. В то же время биоинформатические методы позволяет настолько оптимизировать и рационализировать экспериментальные подходы, что современную «мокрую» биологию становится все сложнее представить без компьютерного моделирования.