У большинства людей есть иммунитет к белку системы CRISPR-Cas13

Открытие системы CRISPR-Cas дало толчок развитию многих терапевтических подходов, основанных на подавлении экспрессии генов, внесении мутаций или на вставке новых генов. Многие эти методы используют наиболее хорошо изученные белки Cas9 из Streptococcus pyogenes (SpCas9) и Streptococcus aureus (SaCas9). Но сообщалось о том, что почти у всех людей есть приобретенный иммунитет к этим белкам. Вероятно, это произошло из-за воздействия на их организм бактерий, из которых были выделены ферменты. РНК-направляемые белки с нуклеазной активностью по отношению к РНК, как выяснили ученые из США и Сингапура, тоже могут быть атакованы иммунными клетками большинства людей.

Нуклеазы, нацеленные на РНК, не несут риска необратимых нецелевых изменений генома и поэтому идеально подходят для применения в терминально дифференцированных клетках, в которых репарация ДНК с помощью гомологичной рекомбинации невозможна. Кроме того, редактирование мРНК может быть полезно для модификации альтернативного сплайсинга, например, при спинальной мышечной атрофии.

Ферменты Cas13 — это белки системы CRISPR типа VI, нуклеазы, таргетирующие РНК. В отличие от Cas9, Cas13 могут нацеливаться на различные сайты, не ограниченные наличием PAM (protospacer adjacent motif). Из известных белков семейства Cas13 один, RfxCas13d, полученный из бактерии Ruminococcus flavefaciens, обладает наиболее высокой эффективностью и минимальным нецелевым редактированием. В работе, опубликованной в Nature Medicine, ученые оценили антительный и Т-клеточный ответ на RfxCas13d у здоровых доноров при помощи ELISA и культивирования Т-клеток.

Чтобы проверить, есть ли в человеческой популяции гуморальный ответ на RfxCas13d, авторы разработали протокол для ELISA для обнаружения IgG в плазме человека. Также они получили рекомбинантные SpCas9 и SaCas9, чтобы сравнить иммунные ответы на различные нуклеазы. Тем же методом они экспрессировали и очистили рекомбинантный зеленый флуоресцентный белок (GFP) в качестве отрицательного контроля.

В 17 из 19 образцов (89%) показатели IgG против RfxCas13d были выше фоновых (фоновыми считались показатели сродства к GFP). Для SpCas9 и для SaCas9 у 18 из 19 (95%) образцов показатели IgG также были выше фона. Если сравнивать ответ на белки Cas13 и Cas9, то в 13 образцах ответ на RfxCas13d был сильнее, чем на SpCas9, а в восьми образцах ответ на RfxCas13d был сильнее, чем на SaCas9.

Полученные данные указывают на то, что у людей в популяции должны быть также и RfxCas13d-специфические Т-клетки, потому что для синтеза IgG необходимы хелперные CD4 Т-клетки. Авторы культивировали мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) в присутствии рекомбинантного RfxCas13d и измеряли индуцированную антигеном пролиферацию. Для сравнения, РВМС стимулировали SpCas9 и SaCas9, а также рекомбинантным GFP и овальбумином в качестве отрицательного контроля. Антиген-индуцированный пролиферативный ответ в CD8 T-клетках наблюдался в 23 из 24 (96%) образцах для всех белков: RfxCas13d, SpCas9 и SaCas9. Для CD4 Т-клеток ответ наблюдался в 22 (92%), 21 (88%) и 24 (100%) из 24 образцах после инкубации с SpCas9, SaCas9 или RfxCas13d соответственно. Эти данные однозначно указывают на существование у большинства людей иммунологического распознавания RfxCas13d, причем существенно не отличающегося от такового для SpCas9 и SaCas9.

Также авторы выяснили, что Т-клетки, отвечающие на RfxCas13d, вырабатывают воспалительные цитокины IFN-γ, TNF-α и IL-17. Теоретически, RfxCas13d можно использовать для уничтожения раковых клеток из-за наличия иммунного ответа. Однако CD4 Т-клетки, продуцирующие IL-17, не эффективны для такой цели и вместо этого могут создавать провоспалительную среду, которая приведет к повреждению тканей.

Обнаружение иммунного ответа на RfxCas13d противоречило ожиданиям ученых, поскольку штамм Ruminococcus flavefaciens XPD3002 был первоначально выделен из рубца крупного рогатого скота и не должен встречаться у людей. Белки Cas13d из родственных видов в кишечнике человека на 35–37% совпадают с RfxCas13d, но дальнейшие исследования показали, что перекрестная реактивность к этим участкам белка не наблюдается в достаточной мере, чтобы объяснять полученные ранее результаты.

Таким образом, ученые показали наличие риска иммуноопосредованной токсичности при применении RfxCas13d для генной терапии. Чтобы избежать активации иммунитета, они предлагают применять иммуносупрессивную терапию.