Эксперты рассказали о распространенности и диагностике туберкулеза в России

Как и на предыдущей встрече, участники вебинара обсудили новые молекулярно-генетические методы выявления туберкулеза (в их числе — иммунодиагностика латентной формы инфекции) и определения лекарственной устойчивости его возбудителей — Mycobacterium tuberculosis.

ПОСМОТРЕТЬ ЗАПИСЬ ВЕБИНАРА

ПРОГРАММА, ИНФОРМАЦИЯ О ДОКЛАДЧИКАХ

Во вступительном слове Игорь Мокроусов, заведующий лабораторией молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетики в НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (Санкт-Петербург), отметил, что текущая пандемия COVID-19 стала серьезным вызовом для программ по борьбе с туберкулезом (ТБ). По данным ВОЗ, в первый год пандемии в мире было выявлено меньше случаев туберкулезной инфекции, но при этом возросла смертность. В России в том же 2020 году также снизилась заболеваемость ТБ (41,2 на 100 тысяч), однако начала расти доля впервые выявленных больных с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) — с 27,2% в 2015 году до 32,4% в 2021-м, причем самые высокие уровни МЛУ-ТБ регистрируются в азиатской части нашей страны. Чем можно объяснить различия в распространении этой инфекции? Прежде всего — особенностями локальных популяций M. tuberculosis, структура которых определяется множеством факторов, связанных с миграцией людей, генетикой человека, эффективностью программ по борьбе с ТБ, а также генетическими и патобиологическими особенностями штаммов возбудителя.

Из всех методов молекулярной диагностики ТБ наиболее современным считается полногеномное секвенирование, которое в свое время позволило выявить такие маркеры, как необратимые делеции крупных фрагментов генома в регионах различия (Region of Difference, RD) относительно референсного генома H37Rv. Это, в свою очередь, дало возможность изучить полиморфизм микобактерий. С помощью этого анализа были обнаружены геномные перестройки и однонуклеотидные замены — нейтральные эволюционные маркеры и мутации, которые приводят к развитию лекарственной устойчивости у пациентов, получающих неадекватное лечение (прерывание курса антибиотиков или их длительный прием).

Докладчик перечислил эпидемически и клинически значимые в России генотипы M. tuberculosis. Из всех известных в мире генотипов M.tuberculosis особое эпидемическое значение имеют два клональных кластера, входящие в Восточно-Азиатскую (Beijing) и Евро-Американскую (LAM и Ural) линии. В генетическом семействе LAM (Latin-American Mediterranean) выделяют несколько сублиний с крупными делециями. Одна из них, RD-Rio (размер делеции ~25 Kb), ассоциирована с МЛУ, отличается особой вирулентностью и трансмиссивностью, с чем связывают ее глобальное распространение. Однако исследование географического распределения сублиний LAM, которое провел Игорь Мокроусов с коллегами еще в 2016 году, показало, что распространение RD-Rio, во-первых, не столь глобально и, во-вторых, связано скорее с массовой миграцией из стран Южной Америки в США, нежели с патобиологией штаммов этой сублинии. В России же преобладают «свои» штаммы, выделенные в сублинию LAM-RUSS. Среди них беспокойство специалистов вызывают два ассоциированные с МЛУ штамма — SIT252 и SIT266, которые пока циркулируют в пределах северо-западной и центральной частей России (SIT252) и на территории Беларуси (SIT266), но могут распространиться более широко.

Генотип Ural долгое время считался низковирулентным, нерезистентным и малотрансмиссивным, что подтвердилось в дальнейших филогеографических исследованиях. Ural распространен в основном в Северной Евразии, а возник не на Урале, как считалось, а в Северном Причерноморье. Однако с 2012–2014 гг. в Молдове, Литве и Европейской части России были обнаружены МЛУ-штаммы Ural, а в 2018 году полногеномное исследование выявило новый эпидемический субтип Ural с шестью мутациями устойчивости к нескольким антибиотикам первого и второго рядов.

Большую часть своего доклада Игорь Мокроусов посвятил древним и современным сублиниям «пекинского» генотипа — Beijing из Восточно-Азиатской линии. Штаммы современной сублинии Beijing доминируют и в мире, и в России. Как и год назад, докладчик рассказал об эпидемиологичекой и клинической значимости современных штаммов Beijing B0/W148 и Beijing CAO с повышенной вирулентностью и ярко выраженной МЛУ, что способствует их успешности в нашей стране. В этом докладе больше внимания уделено древним (предковым) штаммам Beijing, которые преобладают в Японии и Корее (до 70%) и реже встречаются в Китае (20%). В России они составляют только 5% популяции Beijing; из-за их чувствительности к препаратам изучались мало.

Неожиданностью стало обнаружение двух мультирезистентных кластров древних Beijing — Mlva 14717-15 (в Бурятии) и 1071-32 (в Омской обл.). Их вирулентность и летальность были изучены на модельных мышах, и выяснилось, что «бурятский» штамм вызывает значительную потерю веса, высокую бактериальную нагрузку и наиболее тяжелую патологию легких, а его летальность даже выше, чем у российского эпидемического штамма Beijing B0/W148. Изучение причин еще продолжается, но полногеномный анализ Beijing 14717-15 уже выявил у него мутации в участках, имеющих отношение к уклонению от распознавания иммунной системой, и генах, ассоциированных с адаптацией и вирулентностью. К счастью, этот высоколетальный, гипервирулентный и мультирезистентный кластер распространен только в Бурятии на Дальнем Востоке и практически невидим в других регионах. Это противоречит теории о соответствии высокой вирулентности и трансмиссивности, что еще предстоит объяснить. Возможно, этот феномен как-то связан с популяционными особенностями иммунной системы жителей Бурятии и генетическими особенностями штамма Beijing 14717-15, а также их взаимодействием в процессе локальной коэволюции.

Подводя итог, Игорь Мокроусов отметил неоднородность всех крупных филогенетических линий M.tuberculosis. При обнаружении нового эпидемического, эмерджентного генотипа необходимо не только выявить его связь с клиническими проявлениями и оценить риск распространения, но и определить его молекулярные маркеры и разработать метод детекции, дополнив ими существующие схемы молекулярной диагностики.

Татьяна Петренко, профессор кафедры фтизиопульмонологии Новосибирского государственного медицинского университета Минздрава России, начала свой доклад «Организация выявления больных туберкулезом органов дыхания» с демонстрации схемы цепи передачи инфекции, рассказав, что необходимо делать, чтобы ее прервать. Она также перечислила различные нормативно-правовые документы, которые определяют порядок и сроки проведения медосмотров населения для выявления заболевания и мероприятий по профилактике и лечению туберкулеза, какие медицинские учреждения отвечают за их исполнения и т.д. Подробнее были рассмотрены списки симптомов, на которые необходимо обращать внимание при подозрении на туберкулез легочной и внелегочной локализации, какие клинические исследования проводятся в медицинских организация и т.д. Также докладчица дала определение следующим понятиям: раннее выявление туберкулеза, своевременное и несвоевременное выявление, запущенные формы туберкулеза.

Антонина Зинина, ведущий специалист по продвижению продукции ООО «ИнтерЛабСервис» (Москва), рассказала об иммунодиагностике латентной туберкулезной инфекции, новых подходах и методах, существующих в России и мире. По определению ВОЗ, латентная туберкулезная инфекция (ЛТИ) — это состояние стойкого иммунного ответа на антигены микобактерий туберкулеза, попавшие ранее в организм человека и не вызвавшие у него клинических проявлений активной формы туберкулеза. Анализы на выявление ЛТИ рекомендовано систематически проводить у ВИЧ-инфицированных; взрослых и детей, контактировавших с больными легочной формой туберкулеза; пациентов, начинающих лечение по поводу фактора некроза опухоли; пациентов на диализе; людей, готовящихся к трансплантации органов, переливанию крови, а также пациентов с силикозом. Для выявления ЛТИ используют анализ секреции гамма-интерферона (Interferon-Gamma Release Assays, IGRA) либо туберкулиновую кожную пробу (ТКП, реакция Манту). Принцип метода IGRA построен на повторном узнавании специфических антигенов M. tuberculosis Т-лимфоцитами и выделения ими гамма-интерферона.

Антонина Зинина поделилась впечатлениями от конференции «Актуальные вопросы профилактики, диагностики и лечения туберкулеза у детей и взрослых», проходившей недавно в Сочи. Одна из секций конференции была посвящена ЛТИ, где подчеркивалась ведущая роль IGRA-тестов в ранней диагностике ТБ и ЛТИ. Положительный результат анализа требует дальнейшего углубленного обследования, при исключении активного ТБ и обнаружении ЛТИ с признаками активности показано превентивное противотуберкулезное лечение. Главный же вывод, сделанный на секции: основная задача современной фтизиатрии — профилактика ТБ в группах риска, в которой важное место занимает ранняя диагностика с помощью современных методов анализа.

В обзоре ВОЗ 2022 года. «Использование альтернативных анализов высвобождения интерферона-g для диагностики туберкулезной инфекции» обсуждаются пять тестов: QuantiFeron-TB Gold Plus, WANTAI TB-IGRA, TB-Feron IGRA, T-SPOT-TB и QuantiFeron-TB Gold. Последние два — самые популярные в нашей стране, их проводят бесплатно (по клиническим показаниям) в государственных медучреждениях и платно в частных лабораториях. Два других рекомендованных теста — QuantiFeron-TB Gold Plus (Германия) и WANTAI TB-IGRA (Китай) — не зарегистрированы в РФ. Получил регистрационное удостоверение пятый тест — Standard E TB-Feron IGRA ELISA (TBF) от корейской компании SD Biosensor. Тест-набор содержит пробирки с ТБ-специфическими антигенами (рекомбинантными цельными белками ESAT-6, CFP-10 и TB7.7), а также с положительным и отрицательным контролями. Тест высокочувствителен, подходит для любых групп пациентов (в том числе с иммуносупрессией) и крайне прост в использовании; его срок годности — 15 месяцев, и для работы с ним не требуется специальное оборудование, подчеркнула докладчица.

Анна Сафонова, директор по продуктовой политике лаборатории LabQuest (Москва), рассказала на примере своей лаборатории, какие технические возможности есть в отечественных лабораториях для диагностики туберкулеза, и сравнила различные методы, которые используются в рутинной практике. Среди прямых методов диагностики ТБ Анна Петровна особое внимание уделила ПЦР-анализу, из косвенных — двум IGRA-тестам (T-SPOT-TB и QuantiFeron-TB Gold), отметив как их преимущества, так и недостатки, а также объяснила, как интерпретировать результаты анализов.

Юлия Микулович, научный сотрудник Центра стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью ФМБА России (Москва), отметила, что несмотря на улучшение в России эпидемиологической ситуации по туберкулезу, о чем свидетельствует снижение заболеваемости и смертности, продолжается рост доли пациентов с МЛУ-ТБ. Традиционно для определения чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам использовались микробиологические методы. Однако получение результатов анализа затягивается на 1–2 месяца, поскольку микобактерии туберкулеза растут медленно. Прекрасной альтернативой стали молекулярно-генетические методы, позволившие сократить срок получения результата до одного дня. Юлия Микулович представила недавно разработанный и уже зарегистрированный в РФ набор реагентов «АмплиТест МБТ-Резист-I» для выявления мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью микобактерий туберкулеза, методом полимеразной цепной реакции. Этот набор позволяет качественно выявлять мутации в области RRDR и кодоне 572 гена rpoB, связанные с устойчивостью к рифампицину, и в кодоне 315 гена katG и в участке промоторной области гена inhA, связанной с устойчивостью к изониазиду. Такой подход позволяет обнаруживать максимальный спектр мутаций: 32 мутации в гене rpoB, 3 — в katG и 5 — в промоторе inhA. Это было подтверждено при тестировании клинических изолятов в доклинических испытаниях, а также при тестировании панели контрольных образцов с различными мутациями, созданной с помощью синтеза фрагментов генов rpoB, katG, промотора inhA и клонирования их в плазмидный вектор pGEM-T.

Клинические испытания набора реагентов «АмплиТест МБТ-Резист-I» проводились в течение трех месяцев 2021 года в НМИЦ фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний Минздрава РФ. Исследовали мокроту, бронхоальвеолярный лаваж и биоптат, взятые у 200 пациентов с туберкулезом легких. Результаты тестирования «АмплиТест МБТ-Резист-I» были сопоставлены с показателями набора сравнения, при этом диагностические характеристики (чувствительность и специфичность) нового набора составили 100 %. Эти результаты были полностью подтверждены при анализе ДНК из образцов культур M. tuberculosis.

В заключение Юлия Микулович перечислила преимущества «АмплиТест МБТ-Резист-I»: выявление широкого спектра целевых мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью микобактерий; безопасность в отношении контаминации продуктами ПЦР (набор содержит разрушающие их ферменты); адаптация к различным детектирующим амплификаторам и автоматическое управление ими при использовании программного обеспечения FRT Manager, которое позволяет анализировать полученные с прибора данные.