Как российские наборы помогают выявлять инфекции легких и ЖКТ

erid: LdtCKMk2b

Тема сателлитного симпозиума АО «Вектор-Бест» — «Опыт внедрения новых отечественных комплексных разработок приборно-реагентных аналитических систем в практику КДЛ». Модераторами выступили Сергей Казаков, Елизабета Ристанович и Эдуард Аглетдинов.

Елизабета Ристанович, доктор наук, начальник Отделения микробной генетики и иммунологии Института микробиологии Военно-медицинской академии Министерства обороны Республики Сербия, прочитала доклад на тему «Эпидемиология клещевых инфекций в Республике Сербия и на Балканах. Комплексная диагностика клещевых инфекций методами ПЦР и ИФА».

На сегодняшний день известно более 200 заболеваний человека, передающихся членистоногими, среди которых особое значение имеют клещи. Описано около 896 видов клещей, на человеке паразитируют около 40, из них 20 — часто.

Елизабета Ристанович привела основные характеристики твердых и мягких клещей, а также рассказала о географии их распространения. Клещи встречаются почти во всех частях света. Люди не являются естественными хозяевами для клещей любого типа, они случайно попадают в пищевые цепи.

Считается, что клещи возникли в меловом периоде, при этом наиболее распространены они были в третичном периоде. Записи о клещах были найдены в Древнем Египте, также их упоминал Гомер. Их роль как переносчиков различных микроорганизмов была признана в конце XIX века.

Клещи являются важнейшими переносчиками многих заболеваний, таких как болезнь Лайма (клещевой боррелиоз), туляремия, Конго-крымская геморрагическая лихорадка (ККГЛ) и риккетсиозы. Твердые клещи являются более важными переносчиками, чем мягкие. На борьбу с этими заболеваниями уходит много финансовых ресурсов.

Риск передачи инфекционных заболеваний увеличивается, если клещ проводит на хозяине больше времени. Также риск зависит от строения ротового аппарата членистоногого.

Эпидемиология клещевых болезней тесно связана с экологией клещей. Болезни обычно географически локализованы, часто носят сезонный и профессиональный характер. Необходимо разработать местные стратегии профилактики, контроля, диагностики и лечения.

В Сербии наиболее многочисленным является вид клещей Ixodes ricinus, который переносит возбудителей болезни Лайма, клещевой возвратной лихорадки, ККГЛ, анаплазмоза, бабезиозов, клещевого энцефалита, риккетсиозов, туляремии и Ку-лихорадки. Елизабета Ристанович перечислила патогены, которые переносят клещи рода Dermacentor, Rhipicephalus, Haemaphysalis и Hyalomma. Она также привела примеры научных публикаций на тему клещей и клещевых заболеваний.

Основное внимание исследователей было направлено на борьбу с боррелиозами. Возбудитель клещевого боррелиоза (болезни Лайма) — представители комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato, переносчики — иксодовые клещи. Среди клинических проявлений заболевания в острой фазе на первой стадии наиболее часто встречается мигрирующая кольцевая эритема, на второй стадии появляются кардиоваскулярные, неврологические и костно-суставные патологии. В хронической фазе возникают атрофический акродерматит, энцефаломиелит и хронический артрит.

Клещи заразны практически на всех стадиях развития, а мелких клещей иногда очень сложно заметить. Важно правильно удалять клещей.

Первый случай клещевого боррелиоза в Сербии был зарегистрирован в 1987 году. Первая изоляция — в 1992 году. В последние годы регистрируется высокая зараженность клещей (20–30%), а болезнь Лайма — «профессиональное заболевание» работников лесного хозяйства и военнослужащих — стала серьезной проблемой.

В Сербии у иксодовых клещей выделено шесть видов боррелий, клинические проявления у них различаются. Самая распространенная бактерия — B. lusitaniae (18,8%). Один клещ может быть заражен несколькими видами боррелий.

Микробиологические характеристики боррелий, такие как генетическая и антигенная изменчивость, долгий период репликации, возможность секвестрации в иммунопривилегированных тканях и внутриклеточная локализация, — ключ к пониманию патогенеза, сложной клинической картины и проблем диагностики болезни Лайма.

Помимо линейной хромосомы, геном боррелий включает множество кольцевых и линейных плазмид. Это основа антигенной сложности и изменчивости. Исследование генотипической и фенотипической гетерогенности изолятов боррелий важно для понимания иммунопатогенеза, определения путей передачи и поиска вакцины.

Фенотипическая характеризация трех выделенных изолятов боррелий — А1, А2 и М1 — показала, что они, вероятно, принадлежат к одному виду. Но окончательный ответ мог дать только генетический и филогенетический анализ.

ПЦР-амплификация межгенной спейсерной области 5S-23S рДНК и гена флагеллина (flab) показали идентичность сегментов. ПЦР-гель-электрофорез в импульсном поле амплифицированной межгенной спейсерной области 5S-23S рДНК, обработанной рестриктазами, показал, что А1, А2 и М1 принадлежат B. burgdorferi sensu stricto. А вот К1 — это смесь B. burgdorferi sensu stricto и B. afzelii. Это подтвердил филогенетический анализ. Однако использование гена флагеллина показало присутствие только B. afzelii. Вероятно, это была коинфекция различными видами боррелий, а при культивировании in vitro B. afzelii становится доминантным за счет более быстрого роста.

Одновременное заражение разными видами боррелий и коинфицирование клещей другими микробами осложняет клинические проявления и создает проблемы в диагностике. Такие коинфекции были зафиксированы в Белградской области. Еще одно чуть более обширное исследование показало наличие B. burgdorferi, анаплазмы и вируса клещевого менингоэнцефалита.

Современные методы диагностики болезни Лайма основаны на клинической картине, эпидемиологических данных и лабораторных диагностических исследованиях. Выделение и культивирование B. burgdorferi на питательных средах — длительный и трудоемкий процесс. Молекулярные методы, в том числе ПЦР, быстро и надежно обнаруживают бактерий в пробах клещей. Чувствительность ПЦР относительно высока в биоптатах кожи, крайне низка в СМЖ; это метод выбора при подозрении на Лайм-артрит (синовиальная жидкость). Бактериемия кратковременна, поэтому ПЦР не дает хороших результатов в образцах крови.

Иммунодиагностические тесты основаны на обнаружении специфических антигенов в образцах крови, СМЖ и синовиальной жидкости. Алгоритм включает скрининговый и подтверждающий тест. Елизабета Ристанович привела подробный алгоритм диагностики.

Если результат не коррелирует с клинической картиной и другими данными, необходимо объяснить появление ложноположительных и отрицательных результатов.

Чувствительности и специфичность иммунодиагностики зависит от типа используемых антигенов B. burgdorferi с учетом географического распространения видов и их антигенной изменчивости (особенно белков внешней мембраны), а также с учетом возможности множественного заражения. Важен также способ получения антигена.

При интерпретации иммунодиагностических тестов нужно учитывать стадию и длительность заболевания, особенности индивидуального иммунного ответа, возможное наличие других заболеваний, применяемое лечение антибиотиками. При нейроборрелиозе необходимо выявить антитела в СМЖ и так называемый индекс интратекальной продукции.

Елизабета Ристанович рассказала, что иммунодиагностические тесты они ранее готовили самостоятельно, используя местные изоляты в качестве антигенов. Сегодня используются коммерческие тесты с рекомбинантными антигенами.

Помимо болезни Лайма, клещи переносят и другие инфекции, такие как Конго-крымская геморрагическая лихорадка (ККГЛ). Ее вызывает РНК-вирус, летальность достигает 30%. Данный вирус может быть использован в качестве биологического оружия.

Вирус был обнаружен на Крымском полуострове в 1940-е годы, а в 1954 году — в Косово и Метохии. В 1970 году произошла семейная вспышка в Македонии. На юге Сербии наличие вируса было подтверждено с помощью ОТ-ПЦР и анализа последовательности штаммов вируса ККГЛ.

Вирус клещевого энцефалита впервые выделили в 1972 году: на юго-западе Сербии были выявлены два активных микроочага инфицированных клещей. В Сербии ситуация с этим вирусом не вызывает тревогу, но необходимо вести постоянный мониторинг.

Ку-лихорадку вызывает бактерия Coxiella burnetii, которая из-за высокой внеклеточной стабильности и аэрозольной передачи также может рассматриваться как потенциальное биооружие. Заболевание протекает остро или хронически, часто возникает атипичная пневмония. C. burnetii выявлена в Сербии методом ПЦР у клещей различных видов, преимущественно на севере страны. За последние 25 лет серологически подтверждено 2154 случая.

Туляремия — зоонозное заболевание. Возбудитель — бактерия Francisella tularensis. Резервуары — преимущественно мыши и кролики, переносчиками могут быть клещи. Туляремия часто появляется во время военных действий из-за входа армии в естественные очаги и увеличения популяции грызунов.

Первый случай туляремии в Сербии был зарегистрирован в 1958 году. Вся бывшая Югославия — эндемичный район по туляремии, однако первая эпидемия началась в конце 1998 года в районе горы Ртань. Сегодня туляремия в Сербии встречается спорадически, ее выявляют у иксодовых клещей.

Елизабета Ристанович также рассказала про риккетсий, резервуарами и переносчиками которых являются клещи. Клиническая картина клещевых пестрых лихорадок может быть чрезвычайно сложной и тяжелой. Популяция Сербии показывает высокую степень серопозитивности.

Клещи также переносят паразитов рода бабезия, которые паразитируют на эритроцитах человека и животных. Инфекции могут протекать бессимптомно или иметь клиническую картину, напоминающую малярии. В Сербии выявлены инфицированные клещи.

Эрлихоз и анаплазмоз вызываются бактериями, которых тоже могут переносить клещи. Клетки-мишени — гранулоциты и моноциты. Клинико-лабораторные методы выявили случаи заражения человека в Сербии.

Borrelia miyamotoi впервые идентифицирована в 1995 году в Японии. Принадлежит к группе боррелий — возбудителей клещевых возвратных лихорадок. Возбудитель широко распространен в умеренном поясе, хотя степень заражения низкая. Уровень зараженности иксодовых клещей в Белграде — 1,04%.

Клещевые заболевания — серьезная проблема для общественного здравоохранения, экономики и безопасности. Стратегии контроля и защиты включают в себя меры по просвещению и индивидуальной защите, улучшение диагностических процедур, профилактическую антибиотикотерапию и разработка вакцин. Тут есть много возможностей для международного сотрудничества, подчеркнула докладчица.

Юлия Томилова, старший научный сотрудник лаборатории ПЦР (АО «Вектор-Бест», Новосибирск), в докладе «Сезонный мониторинг и информативность лабораторной диагностики респираторных инфекций» представила результаты совместной работы с Новосибирской детской городской клинической больницей №3. Сначала она рассказала о том, почему эта тема важна лично для нее, и об опыте борьбы с респираторной инфекцией, которую пережил ее сын в возрасте нескольких месяцев. Она предостерегла от слепого лечения респираторных инфекций антибиотиками. Своевременная дифференциальная этиологическая диагностика должна позволить выбрать правильную терапию или скорректировать ход лечения.

Исследование проводилось с сентября 2022 по июнь 2023 года. Были проанализированы 1443 носоглоточных мазка детей, поступивших в стационар с симптомами респираторного заболевания. Анализировали их с помощью ПЦР тест-систем «РеалБест» (АО «Вектор-Бест»). Выявляли 16 вирусов и 11 бактерий, а также грибы. Дополнительно оценивали количество ДНК человека для контроля качества забора мазка.

Детей разделили на три группы — до 1 года, 1–5 лет и старше 5 лет. Они были госпитализированы с различными диагнозами, такими как ОРВИ, пневмония и бронхит. Острая кишечная инфекция (ОКИ) шла как сопутствующее заболевание. С возрастом доля пневмонии, но не количество случаев, увеличивается, а доля бронхитов уменьшается. Возможно, детей старшего возраста с бронхитами реже госпитализируют, их лечат амбулаторно.

Юлия Томилова показала график суммарной встречаемости всех респираторных вирусов по неделям в течение эпидсезона. В целом результаты, полученные ее группой, совпадают с данными НИИ гриппа. Однако допандемийные публикации рисуют иную картину. Так, лет 6–8 назад карантин по гриппу объявляли в начале февраля, но теперь пик гриппа сместился на декабрь. РСВ раньше шел параллельно с гриппом с ноября до марта. В этом году последние положительные образцы с РСВ получили в июне, и неясно, закончилась ли вспышка в июне или нет. Метапневмовирус, который раньше был характерен для начала весны, прошел в декабре и январе параллельно с РСВ и гриппом. Отдельные образцы содержали два и более вирусов.

В некоторые недели отбирали по 70–90 образцов. Если бы не планшетный формат наборов «Вектор-Бест», справиться с этим потоком не удалось бы. Стрипованный формат удобен, когда образцов не так много, но если их несколько десятков и есть станция для автоматического выделения, то планшет подходит лучше.

Примерно в половине образцов встречался один вирус. Но с возрастом увеличивается количество образцов, где вируса не выявлено. Например, у детей старше 5 лет таких образцов было 36%. Эта цифра и встречается в литературных данных. Возможно, это связано с тем, что у детей постарше самые распространенные вирусы уже не вызывают тяжелых заболеваний, требующих госпитализации. А эти 36% — редкие инфекции, которые не выявляются обычными тестами. Возможно, на эту группу следует обратить более пристальное внимание.

Однако также существует вероятность, что в этих случаях был плохо взят мазок. Поэтому авторы исследования оценили количество ДНК человека в мазках с помощью набора для валидации. Все образцы с менее 10 тыс. копий на мл считались недостаточно информативными, и действительно, среди образцов без вирусов такой результат был чаще. Авторы рекомендуют использовать тесты для валидации количества ДНК при анализе мазков.

Далее они посмотрели, какие вирусы преобладают в той или иной возрастной группе. РСВ преобладает у детей до года, на втором месте — риновирус. У детей 1–5 лет в лидерах риновирус, потом РСВ, к нему вплотную приближается аденовирус. В обеих этих группах гриппы А и В на последнем месте. А вот у детей старше 5 лет гриппы вошли по крайней мере в пятерку лидеров. Некоторые вирусы чаще встречаются в виде моноинфекций, чем другие.

Зависит ли диагноз от вида вируса? Четкой связи не обнаружилось. Считается, что гриппы А и Б и коронавирусы чаще приводят к тяжелым последствиям. Только их нужно выявлять и лечить. Но, судя по полученным данным, это не так.

Также Юлия Томилова привела график выявленных бактериальных инфекций и грибов. Настораживает число коклюшей. Их не так много, но они есть, а ведь коклюш — это вакциноуправляемая инфекция, все дети от него привиты. При этом дети, госпитализированные с коклюшем, не имели диагноз «коклюш», им диагностировали ОРВИ или бронхит. В остальном наиболее представлены были условные патогены, такие как гемофильная палочка и золотистый стафилококк.

Некоторые вирусы встречаются совместно с определенными условными патогенами. Возможно, эти вирусы ослабляют местный иммунитет и способствуют колонизации или активации носительства. Или, наоборот, если ребенок — носитель инфекции, то при заражении определенным вирусом заболевание протекает тяжелее. Пока неясно, нужно ли лечить носительство.

Также Юлия Томилова привела три клинических случая, когда диагностика позволила скорректировать терапию и выписать пациента. При этом в третьем случае было выявлено одновременно 5 респираторных вирусов, а также бактерии и грибы. На таких детей нужно обращать особое внимание.

Доклад «Метод ПЦР в дифференциальной диагностике острых кишечных инфекций (ОКИ)» прочитал Михаил Иванов, к.б.н., начальник лаборатории ПЦР, АО «Вектор-Бест».

Строгого определения ОКИ нет. В целом это группа инфекционных заболеваний с фекально-оральным типом передачи, в клинической картине которых доминирует поражение ЖКТ. Основные симптомы — это диспепсия, боль в животе, рвота, острая диарея и дегидратация.

По данным ВОЗ, в мире регистрируется около 2 млрд случаев ОКИ в год, умирает более 1,5 млн человек. В России ОКИ занимают второе место после ОРЗ/ОРВИ и приносят более 40 млрд рублей ущерба в год. Во время пандемии число случаев ОКИ снизилось из-за повышения гигиены и снижения числа путешествий.

Основные симптомы ОКИ не являются специфичными. За ОКИ можно принять даже инфаркт миокарда. Поэтому важна дифференциальная диагностика от ОКИ, чтобы показать, что заболевание вообще имеет инфекционную природу.

ОКИ — полиэтиологическая группа заболеваний. Их могут вызывать вирусы, бактерии, простейшие, а иногда — несколько патогенов одновременно. Дифференциальная диагностика ОКИ нужна для правильного и своевременного назначения антибиотикотерапии, а также для предотвращения распространения заболевания.

В России в 2022 году доля случаев ОКИ с установленной этиологией составила 31,19%. Это связано с превалирующим подходом к лечению этих инфекций.

Существуют различные лабораторные методы диагностики ОКИ. Бакпосев — это долго и не применимо для вирусов. Антигенных тестов мало на рынке. Особенно важна ПЦР-диагностика.

Среди нормативных документов особое место занимает МУК 4.2.2746-10. В нем прописаны молекулярно-генетические методы исследования как обязательное дополнение при диагностике ОКИ. Указан минимальный спектр исследований: норовирусы 2 генотипа, ротавирусы группы А, Shigella и энтероинвазивные E. coli, Salmonella, Campylobacter, при необходимости — астровирусы, аденовирусы, иерсиниозы и эшерихиозы. Производители, в том числе и «Вектор-Бест», выпускают свои наборы в полном соответствии с этим списком.

В этом году компания «Вектор-Бест» выпустила линейку наборов «РеалБест-ОКИ». Дополнительно к рекомендованному списку добавлен 1 генотип норавирусов.

Клинические образцы — это образцы фекалий, ректальные мазки и концентраты воды. В наборах — лиофилизированные готовые реакционные смеси, планшетный формат амплификации. От других наборов их отличает возможность анализа ректальных мазков, а также быстрая и очень экономная пробоподготовка, подходящая для потоковой работы и автоматизации.

Пробоподготовка крайне проста. Зонд погружается в образец, переносится в транспортный раствор, образец ресуспендируется. Все это занимает порядка 46 секунд. Это сильно отличается от методических указаний. Процедура, используемая в наборах «Вектор-Бест», быстрее, удобнее и контаминационно более безопасная.

Не приводит ли упрощение процедуры к потерям? Исследования на базе ИНВИТРО показали, что нет. Применение ПЦР для диагностики ОКИ имеет свои нюансы. Фекалии — ненормируемый тип образца. Разница в результатах ПЦР связана не только с пробоподготовкой, но и с особенностями индивидуальной пробы (разное количество ингибиторов). Также высокие нагрузки в пробах возможны по любому из маркеров. Существуют высокие риски контаминации при выделении вручную. А автоматическое выделение НК успешно проходит шахматный тест.

На базе Детской городской клинической больницы №3 проводилось исследование ОКИ среди детей (март-июнь 2023 года). Для 1341 образца был выполнен ПЦР-анализ на 11 возбудителей ОКИ. Это наборы реагентов «РеалБест-ОКИ» и дополнительно лабораторные версии наборов реагентов на саповирусы, энтеровирусы и параховирусы.

В 23,86% образцов был отрицательный результат ПЦР, это довольно хороший выход. В остальных случаях были выявлены моноинфекции (61,67%) и миксинфекции (14,47%). При моноинфекциях лидировали ротавирусы. Но также были выявлены вирусы, которых нет в списке рекомендаций и которые не выявляют основные наборы. В миксинфекциях встречаются любые сочетания вирусов и бактерий и высокие нагрузки. Миксинфекцию нельзя диагностировать без дифдиагностики.

Это исследование — частный случай, но выводы из него можно сделать. Так, одних только рекомендаций недостаточно для выявления всех патогенов. У компании «Вектор-Бест» на этапе разработки есть наборы, которые дополнят наборы «РеалБест-ОКИ», для выявления энтервирусов, параховирусов и протозойных инфекций. В ветеринарной линейке уже есть набор для выявления Clostridium difficile и его токсинов.

Елена Чинахова, специалист по продукции сервисно-методического отдела АО «Вектор-Бест», прочитала доклад «Станция RbMag: универсальное технологическое решения для экстракции нуклеиновых кислот при работе с разными типами биоматериала».

RbMag — это полностью автоматизированный комплекс, собственная разработка АО «Вектор-Бест». Прибор собирается и производится в Новосибирской области. Он позволяет провести полный цикл пробоподготовки или же выполнять отдельные этапы, такие как дозирование проб и (или) растворов, выделение НК, внесение НК в реакционную смесь. Этапы можно комбинировать в полуавтоматическом режиме.

Благодаря гибкости станции есть возможность использовать прибор в комбинации с автоматическим экстрактором и встраивать его в технологическую цепочку, которая реализована в лаборатории. Это позволяет рационально использовать все оборудование лаборатории и добавлять новое, тем самым наращивая потоки.

Все зависит от того, какие исследования проводит лаборатория: и выбор биоматериала (где ищем), и наилучший набор для выделения. Есть несколько типовых готовых решений, а также решения, которые подстраиваются под каждое ЛПУ.

На станциях переливания крови необходимо проверять кровь на ВИЧ и гепатиты. Биоматериал — плазма или сыворотка. Предлагается использовать набор для выделения «ДельтаМаг». НК выделяются из 1 мл, зачастую кровь пулируют. После выделения НК можно внести в реакционную смесь, тут предлагаются набор D-0592 (ВИЧ1/ВИЧ2/ВГВ/ВГС). После этого раскапанные реагенты загружают в амплификатор планшетного типа, который валидирован с этими наборами, и интерпретируют результаты с помощью генераторов планшетов.

Одновременно можно загрузить 48 пулов (образцов) при объеме 1000 мкл. Время цикла — 2 часа 15 минут, то есть за 8 часов рабочего дня спокойно можно сделать две постановки. Сейчас идут КИ набора, которые позволят одновременно проводить исследования для 96 точек из 1000 мкл.

Для центра СПИДа существует другой подход — в основном ВИЧ определяется количественно. Но одновременно может стоять задача выявления ВИЧ, ВГВ и ВГС качественно или количественно, а также определения оппортунистических инфекций. Все эти исследования можно запустить одновременно. Помимо плазмы и сыворотки, исследуют также соскобы. И помимо «ДельтаМаг» можно использовать набор «УниМаг» (100 мкл). В зависимости от образца и набора для выделения можно загрузить от 2 до 5 постановок.

Для многопрофильных диагностических центров может потребоваться определение разнообразных маркеров в широком спектре биоматериалов. Набор «УниМаг» подходит для многих биоматериалов, «Сорбитус» — для респираторных инфекций и «ГенМаг» — для генетических исследований. В один прибор можно загрузить до семи ПЦР-планшетов.

В случае ОКИ полученную пробирку с образцом устанавливают на борт станции. Выделение из 100 мкл производится с помощью набора «УниМаг». После этого станция отбирает материал и вносит его в рабочий раствор. Планшетов может быть до четырех штук.

При респираторных инфекциях используются мазки со слизистой оболочки носо- и ротоглотки. Если у образца есть штрихкод, станция его считает. Наборы — «УниМаг» и «Сорбитус». Можно одновременно вносить рабочие растворы для выявления вирусов и бактерий.

При изучении природноочаговых инфекций биоматериалом служит суспензия клещей. Рекомендуется предварительное измельчение с помощью автоматического гомогенизатора. Можно использовать и другие виды биоматериала. Рекомендуется набор «УниМаг».

Для выявления ВПЧ при комбинированном скрининге рака шейки матки предлагается работать с биоматериалом для жидкостной цитологии или с соскобами.

Генетические исследования можно выполнять после выделения НК набором «ГенМаг». Выделение происходит из цельной крови. Одновременно на станции можно процессировать до 96 образцов. При установке реакционных смесей можно комбинировать разные наборы.

Приборы уже стоят в Перми, Томске, Новосибирске, Иркутске, Челябинске, Иваново, Кемерово, Санкт-Петербурге, Оренбурге, Москве, Уфе и Ростове-на-Дону, отметила докладчица в заключение.

Сателлит «Вектор-Бест»: «Актуальные вопросы инфекционных болезней и вакцинологии»

Реклама. Рекламодатель АО «Вектор-Бест»