New England Biolabs: РНК в медицине

Более 45 лет компания New England Biolabs лидирует в области разработки и продукции реагентов для медицинских и биологических наук. У NEB есть две производственные площадки в США, в штате Массачусетс — в Ипсвиче и в Роули. Вторая была открыта не так давно, и она соответствует всем требованиям, необходимым для производства продуктов класса GMP. На ней производят реагенты для транскрипции РНК in vitro.

Credit:
123rf.com

Методы молекулярной биологии, ранее служившие фундаментальной науке, находят все больше практических применений. О диагностике, основанной на амплификации нуклеиновых кислот, в эпоху коронавирусной пандемии знают все, но есть и множество других примеров. В медицине все чаще используются разнообразные методы анализа ДНК. Биотехнологии предлагают подходы, которые еще недавно считались фантастикой, от терапевтического генного редактирования и РНК-интерференции до вакцин на основе ДНК и РНК.

Биофармацевтические компании отвечают на эти вызовы. В портфеле компании NEB есть продукты для нужд синтетической биологии (клонирование, сборка ДНК и др.), редактирования геномов (CRISPR/Cas), секвенирования нового поколения и геномного профилирования, протеомики, а также манипуляций с РНК: работы с вирусами, изучения экспрессии генов, РНК-интерференции и малых РНК. Эксклюзивный дистрибьютор продукции New England Biolabs в России и СНГ —компания  SkyGen.


Сделай свою РНК

Вакцины на основе мРНК стали главной сенсацией 2020 года. Сразу две мРНК-вакцины против коронавируса, Moderna и Pfizer/BioNTech, оказались лидерами гонки и в конце года были разрешены для экстренного использования. До этого, хотя некоторые мРНК вакцины начали проходить клинические исследования, ни одна не получила разрешения. Сейчас сотни миллионов людей в мире привились этими препаратами, и это открывает пути для новых разработок. Moderna только что начала КИ мРНК-вакцины против сезонного гриппа, и это лишь один из примеров.

Очевидно, что препараты этого класса ждет большое будущее. Появятся не только новые вакцины против инфекционных болезней, но и вакцины против рака, и генная терапия, использующая РНК. Считается, что доставка РНК в клетки более безопасна по сравнению с ДНК, она также технически проще: для нее не требуется электропорация. РНК- вакцины могут производиться полностью in vitro, а не в культурах клеток. Это дает технологические преимущества по сравнению с препаратами на основе ДНК, белков или вирусных векторов.

Тем не менее синтез функциональной мРНК сопряжен с некоторыми тонкостями. Для стабильности молекулы и для того, чтобы ее распознавала система трансляции клетки-хозяина, необходим кэп — специфическая структура на 5’-конце, обычно включающая метилированный в седьмом положении гуанозин (m7G), а также поли(A)-хвост.

Для некоторых применений бывает нужно заменить обычные основания модифицированными. Так, мРНК может содержать обыкновенный рибонуклеотид U (урацил) либо его изомер псевдоуридин. Иммунная система организма-хозяина сильнее реагирует на РНК, богатую урацилом и (или) образующую двухцепочечные участки (шпильки), — то и другое характерно для вирусных РНК. Если мРНК должна быть компонентом вакцины, то иммунный ответ на нее — с одной стороны, хорошо (она сама себе адъювант), с другой, плохо: наша цель — иммунный ответ на белок, который она должна синтезировать прежде, чем иммунная система ее уничтожит.

Чтобы сделать мРНК менее иммуногенной, можно заменить в ней урацилы псевдоуридинами (именно это происходит с собственными РНК эукариот в их клетках). Такая модификация обеспечит продолжительную выработку вирусного белка. Уридины заменены псевдоуридинами в мРНК-компоненте вакцины Pfizer/BioNTech, и некоторые комментаторы считают это секретом ее успеха. Вакцина германской компании CureVac, в отличие от продуктов Moderna и Pfizer/BioNTech, содержала немодифицированную мРНК, и ее эффективность, по-видимому, существенно ниже.

NEB предоставляет множество инструментов для транскрипции РНК in vitro, как в исследовательских лабораториях, так и для крупномасштабного производства. Реагенты можно приобрести отдельно или в виде оптимизированных наборов. NEB также предлагает наборы для очистки РНК, которые эффективно удаляют компоненты реакции, в том числе нуклеотиды, не включенные в цепочку.

Продукты для синтеза РНК

• Фермент для кэпирования из вируса осповакцины

• Ингибитор РНКазы (рекомбинантный белок мыши)

• РНК-полимераза Т7

• Пирофосфатаза (E. coli), катализирует гидролиз неорганического пирофосфата

• мРНК-кэп 2´-O-метилтрансфераза

• ДНКаза I (не содержащая РНКазы)

Набор для синтеза РНК HiScribe дает высокие выходы высококачественной РНК, которую можно использовать в самых разных областях. Он включает все необходимые реагенты для каждого из этапов — от создания матрицы и ее транскрипции до присоединения кэпа и поли(А)-хвоста и очистки после синтеза.

Недавно NEB открыла современный производственный объект площадью 43000 кв. футов в Роули, штат Массачусетс, для производства биопрепаратов класса GMP (Good Manufacturing Practice ) — примерно в 15 минутах от основного предприятия компании в Ипсвиче. (Однако не вся продукция завода в Роули производится по стандарту GMP, а только та для которой это специально указано.)

Производство реагентов, как исследовательского класса, так и GMP возможно масштабировать — от микрограммов для исследовательских целей до граммов терапевтических мРНК.


GMP: что это такое и почему важно

GMP — надлежащая производственная практика (good manufacturing practice) — набор положений, правил и руководств, которые регламентируют производство и контроль качества лекарственных средств для медицины и ветеринарии. Правила GMP включают требования к системе обеспечения качества, персоналу, помещениям и оборудованию, документации, требования к производству продукции (в том числе по контракту), к контролю качества, рекламациям и отзыву продукции, проведению самоинспекций и другим аспектам производственной деятельности. Они охватывают весь жизненный цикл продукта, от разработки до производственного процесса, тестирования, хранения и отгрузки.

Жесткие правила, регулирующие деятельность фармпроизводств, впервые появились в начале ХХ века, когда лекарственные средства стали производиться в промышленных объемах и соответственно возросли риски для потребителей, если продукт окажется небезопасным. Правила надлежащей производственной практики в каждой стране свои, но в любом случае основная их цель — минимизировать эти риски.

Для продуктов класса GMP, в отличие от реагентов исследовательского класса (research-grade), не допускаются вариации качества от партии к партии. В обязательном порядке определяется бионагрузка (количество микроорганизмов) и уровни бактериальных эндотоксинов в реагентах. Имеются сертификаты об отсутствии компонентов животного происхождения при производстве и конечном составе. Это важно не только с этической точки зрения.

Компоненты, получаемые из крупного рогатого скота, например, бычий сывороточный альбумин (BSA) или фетальная бычья сыворотка (FBS), могут содержать прионы — белковые инфекционные агенты, вызывающие нейродегенеративные заболевания. После вспышки «коровьего бешенства» в Великобритании в 1980–1990-е годы, когда было забито несколько миллионов голов скота и умерло по меньшей мере 177 человек, отношение к безопасности продуктов «коровьего» происхождения крайне серьезное, хотя сейчас это заболевание считается ликвидированным. (О моратории на научные исследования прионов во Франции из-за болезни и смерти сотрудницы института — на PCR.NEWS.)

Насколько значимо для фармпроизводства документальное подтверждение исключенного риска TSE/BSE (transmissible spongiform encephalopathy/bovine spongiform encephalopathy), можно судить по сложностям, с которыми встретилась регистрация вакцины «Спутник V» в Евросоюзе. Среди претензий Европейского агентства по лекарственным средствам к нашим производителям вакцины был вопрос  о происхождении фетальной бычьей сыворотки, которая использовалась для выращивания клеток при производстве вакцинного вектора.

С другой стороны, не всем необходимы реагенты класса GMP. Реактивы исследовательского класса, соответствующие международным отраслевым стандартам ISO13485 и 9001, по чистоте и качеству эквивалентны им. Таким образом, если не предполагается использование экспериментального продукта в качестве лекарства, стоит остановить выбор на них (см. таблицу).

Параметры материалов исследовательского класса и GMP-класса

Исследовательские продукты (Ипсвич, MA, США)

Продукты по стандартам GMP (Роули, MA, США)

Производственные процессы

• В процессе производства или в окончательном составе продукта может использоваться материал животного происхождения (например, БСА)
• При необходимости материалы животного происхождения можно исключить
• Производственный процесс может меняться в зависимости от требований к масштабу.
• Продукты подлежат договорному контролю изменений.
• В производственном процессе и конечном составе не присутствуют компоненты животного происхождения
• Полностью охарактеризованные банки клеток, специальные смолы для хроматографии, фильтрация в стерильные контейнеры
• Строгая система контроля изменений снижает риски и обеспечивает дополнительную прозрачность

Характеристики продуктов

• Информация об отслеживании сырья и готовой продукции доступна по запросу.
• Расширенные инструкции прилагаются ко всем продуктам, индивидуальные инструкции доступны по запросу.
• Для всех продуктов проводятся строгие анализы с предоставлением критериев годности/негодности
• Отсутствие TSE/BSE – сырье, рецептура реагента и процесс производства не предполагает использование животных
• Все продукты проходят тестирования, в том числе на эндотоксины и уровень бионагрузки
• Квалифицированные анализы для всех продуктов: гДНК E.coli и другие анализы для контроля контаминации (количественно)

QA и нормативные требования

• Сертификация ISO 9001 и ISO 13485
• Надежные производственные отчеты по всем продуктам • Управление изменениями и размещением партий

• Сертификация ISO 9001 и ISO 13485
• История партий и хранение отчетов, установленные CQA и CPP*
• Расширенное управление изменениями и размещением партий

* Critical Quality Attributes (CQA) – A physical, chemical, biological, or microbiological property or characteristic that should be within an appropriate limit, range, or distribution to ensure the desired product quality. Critical Process Parameter (CPP) – A process parameter whose variability has an impact on a CQA and therefore should be monitored or controlled to ensure the process produces the desired quality. Иначе говоря, автоматизированное производство соответствует требованиям к качеству от партии к партии, а также собирает всю информацию о каждой партии товара.


NEB всегда старалась соответствовать высоким экологическим и социальным стандартам, что крайне непросто для life science. 29 марта NEB объявила, что стала сертифицированной B Corporation (B Corp), «присоединившись к глобальному сообществу людей, использующих бизнес как силу добра». Это означает, что NEB стала одной из первых биотехнологических компаний, убедительно доказавших свою приверженность охране окружающей среды и социальной ответственности. Этот сертификат получили всего около 4000 компаний из различных индустрий. Формально он не дает никаких привилегий, но повышает уважение к компании, которая заботится не только о собственной прибыли, но и об устойчивом развитии нашей планеты.

Партнерский материал

Добавить в избранное

Вам будет интересно