New England Biolabs: РНК в медицине
Более 45 лет компания New England Biolabs лидирует в области разработки и продукции реагентов для медицинских и биологических наук. У NEB есть две производственные площадки в США, в штате Массачусетс — в Ипсвиче и в Роули. Вторая была открыта не так давно, и она соответствует всем требованиям, необходимым для производства продуктов класса GMP. На ней производят реагенты для транскрипции РНК in vitro.

Методы молекулярной биологии, ранее служившие фундаментальной науке, находят все больше практических применений. О диагностике, основанной на амплификации нуклеиновых кислот, в эпоху коронавирусной пандемии знают все, но есть и множество других примеров. В медицине все чаще используются разнообразные методы анализа ДНК. Биотехнологии предлагают подходы, которые еще недавно считались фантастикой, от терапевтического генного редактирования и РНК-интерференции до вакцин на основе ДНК и РНК.
Биофармацевтические компании отвечают на эти вызовы. В портфеле компании NEB есть продукты для нужд синтетической биологии (клонирование, сборка ДНК и др.), редактирования геномов (CRISPR/Cas), секвенирования нового поколения и геномного профилирования, протеомики, а также манипуляций с РНК: работы с вирусами, изучения экспрессии генов, РНК-интерференции и малых РНК. Эксклюзивный дистрибьютор продукции New England Biolabs в России и СНГ —компания SkyGen.
Сделай свою РНК
Вакцины на основе мРНК стали главной сенсацией 2020 года. Сразу две мРНК-вакцины против коронавируса, Moderna и Pfizer/BioNTech, оказались лидерами гонки и в конце года были разрешены для экстренного использования. До этого, хотя некоторые мРНК вакцины начали проходить клинические исследования, ни одна не получила разрешения. Сейчас сотни миллионов людей в мире привились этими препаратами, и это открывает пути для новых разработок. Moderna только что начала КИ мРНК-вакцины против сезонного гриппа, и это лишь один из примеров.
Очевидно, что препараты этого класса ждет большое будущее. Появятся не только новые вакцины против инфекционных болезней, но и вакцины против рака, и генная терапия, использующая РНК. Считается, что доставка РНК в клетки более безопасна по сравнению с ДНК, она также технически проще: для нее не требуется электропорация. РНК- вакцины могут производиться полностью in vitro, а не в культурах клеток. Это дает технологические преимущества по сравнению с препаратами на основе ДНК, белков или вирусных векторов.
Тем не менее синтез функциональной мРНК сопряжен с некоторыми тонкостями. Для стабильности молекулы и для того, чтобы ее распознавала система трансляции клетки-хозяина, необходим кэп — специфическая структура на 5’-конце, обычно включающая метилированный в седьмом положении гуанозин (m7G), а также поли(A)-хвост.
Для некоторых применений бывает нужно заменить обычные основания модифицированными. Так, мРНК может содержать обыкновенный рибонуклеотид U (уридин) либо его изомер псевдоуридин. Иммунная система организма-хозяина сильнее реагирует на РНК, богатую уридиновыми остатками и (или) образующую двухцепочечные участки (шпильки), — то и другое характерно для вирусных РНК. Если мРНК должна быть компонентом вакцины, то иммунный ответ на нее — с одной стороны, хорошо (она сама себе адъювант), с другой, плохо: наша цель — иммунный ответ на белок, который она должна синтезировать прежде, чем иммунная система ее уничтожит.
Чтобы сделать мРНК менее иммуногенной, можно заменить в ней уридины псевдоуридинами (именно это происходит с собственными РНК эукариот в их клетках). Такая модификация обеспечит продолжительную выработку вирусного белка. Уридины заменены псевдоуридинами в мРНК-компоненте вакцины Pfizer/BioNTech, и некоторые комментаторы считают это секретом ее успеха. Вакцина германской компании CureVac, в отличие от продуктов Moderna и Pfizer/BioNTech, содержала немодифицированную мРНК, и ее эффективность, по-видимому, существенно ниже.
NEB предоставляет множество инструментов для транскрипции РНК in vitro, как в исследовательских лабораториях, так и для крупномасштабного производства. Реагенты можно приобрести отдельно или в виде оптимизированных наборов. NEB также предлагает наборы для очистки РНК, которые эффективно удаляют компоненты реакции, в том числе нуклеотиды, не включенные в цепочку.
Продукты для синтеза РНК
• Фермент для кэпирования из вируса осповакцины
• Ингибитор РНКазы (рекомбинантный белок мыши)
• РНК-полимераза Т7
• Пирофосфатаза (E. coli), катализирует гидролиз неорганического пирофосфата
• мРНК-кэп 2´-O-метилтрансфераза
• ДНКаза I (не содержащая РНКазы)
Набор для синтеза РНК HiScribe дает высокие выходы высококачественной РНК, которую можно использовать в самых разных областях. Он включает все необходимые реагенты для каждого из этапов — от создания матрицы и ее транскрипции до присоединения кэпа и поли(А)-хвоста и очистки после синтеза.
Недавно NEB открыла современный производственный объект площадью 43000 кв. футов в Роули, штат Массачусетс, для производства биопрепаратов класса GMP (Good Manufacturing Practice ) — примерно в 15 минутах от основного предприятия компании в Ипсвиче. (Однако не вся продукция завода в Роули производится по стандарту GMP, а только та для которой это специально указано.)
Производство реагентов, как исследовательского класса, так и GMP возможно масштабировать — от микрограммов для исследовательских целей до граммов терапевтических мРНК.
GMP: что это такое и почему важно
GMP — надлежащая производственная практика (good manufacturing practice) — набор положений, правил и руководств, которые регламентируют производство и контроль качества лекарственных средств для медицины и ветеринарии. Правила GMP включают требования к системе обеспечения качества, персоналу, помещениям и оборудованию, документации, требования к производству продукции (в том числе по контракту), к контролю качества, рекламациям и отзыву продукции, проведению самоинспекций и другим аспектам производственной деятельности. Они охватывают весь жизненный цикл продукта, от разработки до производственного процесса, тестирования, хранения и отгрузки.
Жесткие правила, регулирующие деятельность фармпроизводств, впервые появились в начале ХХ века, когда лекарственные средства стали производиться в промышленных объемах и соответственно возросли риски для потребителей, если продукт окажется небезопасным. Правила надлежащей производственной практики в каждой стране свои, но в любом случае основная их цель — минимизировать эти риски.
Для продуктов класса GMP, в отличие от реагентов исследовательского класса (research-grade), не допускаются вариации качества от партии к партии. В обязательном порядке определяется бионагрузка (количество микроорганизмов) и уровни бактериальных эндотоксинов в реагентах. Имеются сертификаты об отсутствии компонентов животного происхождения при производстве и конечном составе. Это важно не только с этической точки зрения.
Компоненты, получаемые из крупного рогатого скота, например, бычий сывороточный альбумин (BSA) или фетальная бычья сыворотка (FBS), могут содержать прионы — белковые инфекционные агенты, вызывающие нейродегенеративные заболевания. После вспышки «коровьего бешенства» в Великобритании в 1980–1990-е годы, когда было забито несколько миллионов голов скота и умерло по меньшей мере 177 человек, отношение к безопасности продуктов «коровьего» происхождения крайне серьезное, хотя сейчас это заболевание считается ликвидированным. (О моратории на научные исследования прионов во Франции из-за болезни и смерти сотрудницы института — на PCR.NEWS.)
Насколько значимо для фармпроизводства документальное подтверждение исключенного риска TSE/BSE (transmissible spongiform encephalopathy/bovine spongiform encephalopathy), можно судить по сложностям, с которыми встретилась регистрация вакцины «Спутник V» в Евросоюзе. Среди претензий Европейского агентства по лекарственным средствам к нашим производителям вакцины был вопрос о происхождении фетальной бычьей сыворотки, которая использовалась для выращивания клеток при производстве вакцинного вектора.
С другой стороны, не всем необходимы реагенты класса GMP. Реактивы исследовательского класса, соответствующие международным отраслевым стандартам ISO13485 и 9001, по чистоте и качеству эквивалентны им. Таким образом, если не предполагается использование экспериментального продукта в качестве лекарства, стоит остановить выбор на них (см. таблицу).
Параметры материалов исследовательского класса и GMP-класса
Исследовательские продукты (Ипсвич, MA, США) |
Продукты по стандартам GMP (Роули, MA, США) |
|
Производственные процессы |
• В процессе производства или в окончательном составе продукта может использоваться материал животного происхождения (например, БСА) • При необходимости материалы животного происхождения можно исключить • Производственный процесс может меняться в зависимости от требований к масштабу. • Продукты подлежат договорному контролю изменений. |
• В производственном процессе и конечном составе не присутствуют компоненты животного происхождения • Полностью охарактеризованные банки клеток, специальные смолы для хроматографии, фильтрация в стерильные контейнеры • Строгая система контроля изменений снижает риски и обеспечивает дополнительную прозрачность
|
Характеристики продуктов |
• Информация об отслеживании сырья и готовой продукции доступна по запросу. • Расширенные инструкции прилагаются ко всем продуктам, индивидуальные инструкции доступны по запросу. • Для всех продуктов проводятся строгие анализы с предоставлением критериев годности/негодности |
• Отсутствие TSE/BSE – сырье, рецептура реагента и процесс производства не предполагает использование животных • Все продукты проходят тестирования, в том числе на эндотоксины и уровень бионагрузки • Квалифицированные анализы для всех продуктов: гДНК E.coli и другие анализы для контроля контаминации (количественно) |
QA и нормативные требования |
• Сертификация ISO 9001 и ISO 13485 • Надежные производственные отчеты по всем продуктам • Управление изменениями и размещением партий
|
• Сертификация ISO 9001 и ISO 13485 • История партий и хранение отчетов, установленные CQA и CPP* • Расширенное управление изменениями и размещением партий |
* Critical Quality Attributes (CQA) – A physical, chemical, biological, or microbiological property or characteristic that should be within an appropriate limit, range, or distribution to ensure the desired product quality. Critical Process Parameter (CPP) – A process parameter whose variability has an impact on a CQA and therefore should be monitored or controlled to ensure the process produces the desired quality. Иначе говоря, автоматизированное производство соответствует требованиям к качеству от партии к партии, а также собирает всю информацию о каждой партии товара.
NEB всегда старалась соответствовать высоким экологическим и социальным стандартам, что крайне непросто для life science. 29 марта NEB объявила, что стала сертифицированной B Corporation (B Corp), «присоединившись к глобальному сообществу людей, использующих бизнес как силу добра». Это означает, что NEB стала одной из первых биотехнологических компаний, убедительно доказавших свою приверженность охране окружающей среды и социальной ответственности. Этот сертификат получили всего около 4000 компаний из различных индустрий. Формально он не дает никаких привилегий, но повышает уважение к компании, которая заботится не только о собственной прибыли, но и об устойчивом развитии нашей планеты.
Партнерский материал