Сокровища музеев. Кто и зачем выделяет ДНК из экспонатов

Самая чистая комната музея

В естественнонаучных музеях всего мира хранятся миллионы экспонатов, представляющих разнообразие фауны нашей планеты. И по мере того, как зоология из описательной науки все больше становится молекулярно-генетической, музейные коллекции приобретают новое информационное измерение. Появилась возможность экстрагировать ДНК из тушек и чучел, из заспиртованных и заформалиненных препаратов, анализировать ее и получать ответы на разнообразные вопросы зоологии. Эта ДНК из образцов, собранных натуралистами в течение веков, носит название исторической, ее возраст — от десятков до сотен лет (в отличие от палеоДНК из образцов, возраст которых тысячи и десятки тысяч лет). Молекулярно-генетические лаборатории сегодня существуют при всех крупных музеях естественной истории.

С 2016 года лаборатория исторической ДНК работает и в Зоологическом музее МГУ в Москве, в ее создании приняли участие сотрудники кафедры зоологии позвоночных биологического факультета МГУ. В старом здании на Большой Никитской выделили подходящее помещение, где покрыли стены специальной краской, на которой не оседает пыль, и установили трехступенчатую систему фильтрации воздуха с отрицательным давлением. Это необходимо для создания «чистого» помещения, где можно работать с древней ДНК. Молекулярно-генетическое оборудование удалось закупить, когда Московский университет получил грант на разработку научных основ биобанка — депозитария живых систем. Так в Зоомузее появились ламинарные боксы, термостаты, центрифуги, амплификаторы и прочее.

Небольшое помещение лаборатории состоит из нескольких отсеков. В «предбаннике» сотрудники переодеваются в стерильные защитные комплекты — комбинезон с капюшоном, бахилы, перчатки, маску. В промежуточном отсеке происходит подготовка материала, в специальном боксе из кости или из других материалов высверливают либо вырезают нужный фрагмент. В следующем отсеке, собственно, выделяют ДНК, за ним отсек для проведения ПЦР и анализа. После работы с каждым образцом помещение тщательно моют, чтобы избежать контаминации посторонней ДНК.

Фото: Александр Ладыгин

Хотя историческая ДНК намного моложе, чем палеоДНК, в работе с ней есть свои сложности.

— Качество ДНК из музейного образца очень зависит от способа обработки — презервации, и от того, в каких условиях он хранился в коллекции, — объясняет научный сотрудник кафедры зоологии позвоночных биологического факультета МГУ Александра Лисенкова. Сегодня лаборатория — это ее хозяйство. — На сохранность ДНК влияет воздействие света и температуры. Мы никогда не можем по внешнему виду образца предугадать, содержится ли в нем ДНК, пригодная для анализа. Мы можем применить свои знания химии и общий опыт, но получится или нет, становится ясно уже в процессе.

Александра Лисенкова. Фото: Александр Ладыгин

Особенно трудно работать с образцами, которые были зафиксированы в формалине, — классический способ консервации биоматериалов в науке и медицине.

— Выделить ДНК из формалинных образцов можно, — говорит Александра, — но в ней присутствуют поперечные сшивки — crosslinks, которые мешают проведению ПЦР, так как фермент не может через них проходить. В некоторых случаях эта задача может решаться с помощью специальных наборов, предназначенных для зафиксированной в формалине ткани. У меня был опыт выделения ДНК из образца, который был зафиксирован в формалине, а в процессе хранения его переместили в спирт. На ней получилось провести ПЦР и прочитать кусочки фрагментов, хотя выход там был достаточно низким. Такая методологическая задача решается всегда на конкретном объекте, а все объекты разные, это может быть кость или мышечная ткань млекопитающего, хитиновый покров насекомого. В большой степени успех нашей работы зависит от везения.

«Обратиться к первоисточнику»

К Александре Лисенковой и ее коллеге Варваре Богатыревой обращаются специалисты по разным группам животных, каждый со своей задачей. Например, нужно сравнить разные экземпляры одного вида с типовым образцом — голотипом, хранящимся в музейной коллекции. Или сравнить экземпляры, собранные в разных географических точках. «Ловили долгое время мышек, которые вроде бы выглядят так же, как первый описанный образец, но точно ли это один и тот же вид или просто похожий на него? — рассказывает Александра. — В этом случае надо обратиться в первоисточнику, так же, как делают хорошие журналисты, которые не переписывают материал друг у друга. Так и здесь. Первоисточник — это музейный образец».

Иногда музейными образцами ученые дополняют выборку экземпляров вида, которые по каким-то причинам сейчас невозможно получить из той или иной географической точки.

— Чаще мы работаем с митохондриальной ДНК, ее проще выделить, так как в клетке много митохондрий, и она лучше сохраняется в древнем геноме, — говорит Александра. — Распространенные митохондриальные маркеры, которыми мы занимается, — это ген первой субъединицы цитохромоксидазы, который используется для баркодинга видов, ген цитохрома В, ген второй субъединицы NADH-дегидрогеназы, D-петля и ее части. Но иногда бывают нужны какие-то специфические митохондриальные маркеры, мы их тоже можем анализировать. С ядерной ДНК мы также работаем, например, в 2022 году вышла статья в Scientific Reports, где мы выделяли ядерные гены нескольких видов тушканчиков и анализировали ядерные маркеры.

В этой работе ученые исследовали семь ядерных генов и митохондриальный ген cytb, чтобы построить молекулярное филогенетическое дерево подсемейства Allactaginae, к которому относятся тушканчики. Они уточнили родственные связи между видами этого семейства и реконструировали историю видообразования тушканчиков. По их оценкам, последний общий предок современных Allactaginae жил 5,7–5,8 млн лет назад — позже, чем считали ранее. Используя моделирование и данные о палеоландшафтах, авторы проследили дивергенцию и миграцию разных родов, вычислили возраст основных таксономических групп тушканчиков.

Вот еще несколько примеров исследования музейных образцов. С глазчатой ящуркой Eremias multiocellata работала к.б.н. Евгения Соловьева, научный сотрудник Зоомузея МГУ. Анализ ДНК из образцов ящериц, собранных в XIX веке, указал на таксономический статус разных экземпляров и позволил оценить степень генетического разнообразия группы.

Евгения Соловьева. Фото: Надежда Маркина

В самом первом проекте Евгения с коллегами изучали хентаунскую круглоголовку Phrynocephalus rossikowi — ящерицу, обитающую в Туркменистане, куда сейчас невозможно организовать экспедицию для ее поисков. Удалось выделить ДНК из высушенной шкурки в коллекции Зоомузея, получить данные по трем генам, и хентаунская круглоголовка заняла свое место на филогенетическом дереве круглоголовок. Музейные образцы ночницы Myotis tschuliensis использовали для сравнения этих летучих мышей, живущих на Кавказе и в Туркменистане. У еще одной группы рукокрылых — нетопырей по музейному образцу удалось описать новый подрод.

Хентаунская круглоголовка. Фото предоставлено Е. Соловьевой

В работе с тяньшанскими мышовками Sicista tianschanica — эндемиком гор Центральной Азии, биологи на музейных образцах сравнивали несколько групп с разными кариотипами, для которых был неизвестен их таксономический статус. Они выделили митохондриальную и ядерную ДНК и построили филогенетические деревья по генам cytb, IRBP и BRCA1. Генетические клады, выявленные на этих деревьях, сравнили с четырьмя группами, отличающимися по кариотипам. Анализ показал, какие группы мышовок представляют собой отдельные виды.

Исследование музейных образцов самого мелкого млекопитающего — белозубки Crocidura по двум ядерным и двум митохондриальным генам показало положение на филогенетическом дереве двух видов, C. serezkyensis и C. arispa.

«Еще несколько лет назад достаточно было просто привести в статье данные по исторической ДНК, и это было круто, — говорит Александра Лисенкова. — Теперь этого уже недостаточно. Теперь надо, чтобы молекулярно-генетическое исследование стало частью комплексного проекта, добавило кусочек паззла к общей картине. Конечно, особенно ценна историческая ДНК, выделенная из образцов вымерших видов, которых уже не существует в природе. Это один из очень-очень немногих способов что-то о них узнать, кроме морфологии». Работа с вымершими видами есть среди направлений лаборатории в Зоомузее. Говорить о результатах пока преждевременно, но можно ожидать, что законсервированная в музейных образцах информация будет прочитана, и мы узнаем много нового о предках современных животных.

«Люди, работающие в музеях, буквально сидят на золоте»

Почему для зоологов неоценима возможность исследовать ДНК из музейных образцов, нам объясняет д.б.н. Анна Банникова, руководитель молекулярно-биологической лаборатории на кафедре зоологии позвоночных биофака МГУ.

Анна Банникова

«Мы решили создать такую лабораторию у себя в Зоомузее, потому что в какой-то момент уперлись в то, что не можем решить некоторые задачи без архивных образцов. Конечно, у меня есть образцы, собранные 30 лет назад, и когда я их собирала, то сразу делала препараты для работы с ДНК. Но архивные образцы — это и 50, и 100 лет назад. Человек просто черепа чистил, шкурки складывал в коробочки, никто не думал, что из них потом потребуется ДНК выделять.

А нам оказалось нужно получить ДНК из таких образцов — чтобы пополнить географическую выборку для тех или иных видов, и понять, как распределена генетическая изменчивость, как ареал формировался, как шло расселение, какова была эффективная численность видов на разных этапах их истории. Нам нужен материал из всех точек ареала, но мы не можем его получить, потому что в какие-то места мы просто не можем попасть, в каких-то местах сменился ландшафт, и теперь там антропоген, и вообще, чем организовывать дорогостоящую экспедицию, пытаясь поймать зверька в природе, дешевле и проще использовать музейный образец. А если мы что-то собрали сегодня из современных популяций, то нередко сомневаемся в правильном определении вида, потому что не всегда это можно сделать на основе морфологических признаков: морфология у многих видов очень изменчива, признаки близких видов перекрываются.

Но и получив последовательность ДНК, чтобы поставить правильный диагноз, нужно сравнить ее с музейным образцом — с голотипом. Все музеи очень скоро придут к тому, что к каждому голотипу должен прилагаться генотип, полученный хотя бы по одной митохондриальной последовательности, как еще один необходимый диагностический признак.

У нас сейчас тянется такая неозвученная (но опубликованная) дискуссия с китайскими коллегами, которые сразу вслед за нами нашли в Китае землеройку-бурозубку и дали ей имя давно описанного вида Sorex sinalis (Thomas, 1912). Но никто не генотипировал более чем 100-летний типовой экземпляр китайской бурозубки, хранящийся в Британском музее естественной истории, поэтому сравнить современный материал не с чем, и прямых доказательств нет. Наши коллеги даже не изучали самолично типовую серию для морфологического сравнения со своими экземплярами, судя из их публикаций, просто сравнили описание из определителей и решили, что по морфологии они очень похожи.

Благодаря сотрудничеству с коллегами из Британского музея естественной истории, в котором хранится типовая серия, нам удалось провести морфологическое сравнение черепов и шкурок этих загадочных землероек с землеройками, собранными Томасом в 1912. И мы видим, что это не так: различаются эти зверьки, и, следовательно, скорее всего мы имеем дело не с Sorex sinalis, а с новым, еще не описанным видом. Чтобы это доказать, совершенно, необходимо получить ДНК из голотипа, но, увы, сейчас такое сотрудничество с европейскими музеями затруднительно.

Там же находится голотип другой землеройки, тоже из Китая, который несколько лет назад нам удалось генотипировать, благодаря чему был описан и правильно назван новый род китайских короткохвостых землероек из провинции Ганьсу.

А вообще приближаются времена, когда все биологи осознают, что люди, работающие в музеях, буквально сидят на золоте, потому что уже сейчас все больше проблем с тем, чтобы добывать материал в поле — экспедиции затратны, этические комиссии слишком придирчивы, «зеленые» слишком далеки от науки, так что скоро надо будет получать разрешение на то, чтобы крысу убить у себя в подполе. Все это осложняется транспортировкой биоматериала — по факту вы должны получить разрешение на вывоз какого-то материала за два месяца до того, как вы его добыли, указав полный список видов и количество экземпляров. И поэтому все музейные материалы, если с ними научиться правильно работать, могут скоро превратиться в единственный источник, бесценный для практикующих зоологов».