Специфические методы диагностики коронавирусной инфекции в России: результаты вебинара

Конспект, полный отчет и видео прошедшего вебинара, где ведущие международные эксперты обсудили проблемы разработки тест-систем для диагностики COVID-19, детерминанты чувствительности и специфичности существующих тестов, применение ИФА-тестов и интерпретацию результатов серологического анализа, а также омиксный подход к изучению новой коронавирусной инфекции.

В вебинаре приняли участие:

Герман Шипулин, заместитель генерального директора по научно-производственной деятельности ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, руководитель проектов по созданию ПЦР тест-систем для диагностики COVID-19.

Олег Гусев, PhD, к.б.н., заведующий лабораторией КФУ-RIKEN «Функциональная Геномика», RIKEN, Россия-Япония.

Клаудио Галли, MD, PhD, директор глобальной медицинской службы Abbott Laboratories, Италия.

Татьяна Смолянова, руководитель проектов, АО «Нацимбио», АО НПО «Микроген», Москва.

Анастасия Самсонова, профессор Центра геномной биоинформатики им. Добржанского, СПбГУ.

Вебинар также поддержала компания ЗАО «АНАЛИТИКА». Компания оснащает медицинские лаборатории с 1989 года. В настоящий момент предлагает ИФА-наборы EUROIMMUN (Германия) для высокоспецифичного определения антител IgG и IgA к S1-белку SARS-CoV-2, имеющих приоритетное значение для оценки протективного иммунитета в острой и постинфекционной фазах заболевания.


Вебинар начался с подробного рассказа Германа Шипулина о проблемах молекулярной диагностики COVID-19 в России. По его словам, молекулярная диагностика играет решающую роль на ранних этапах вспышки инфекционного заболевания. Шипулин представил организацию ответа на эпидемию в виде пирамиды, выделив первичный уровень (работа с пациентами в поликлиниках и ФАПах), средний уровень (уровень инфекционных больниц) и уровень референс-центров. Он отметил сильные и слабые места этой пирамиды в России, рассказал об актуальной ситуации с производством ПЦР-тест-систем в стране и о личном опыте организации такого производства.

Шипулин рассказал о тонкостях создания ПЦР-тестов и о сложностях, с которыми сталкивается разработчик на всех этапах: от подбора праймеров до выбора биоматериала для тестирования. Он особо подчеркнул необходимость использования внутреннего контрольного образца — это исключит ложноотрицательные результаты. Кроме того, для точной диагностики COVID-19 недостаточно только одного вида клинического материала от пациента. Объединение разных видов образцов — например, фекалий и назофарингеального мазка — сильно повышает чувствительность анализа.

В финале выступления Шипулин сделал краткий обзор тестов на коронавирус, проверенных его командой, и отметил преимущества теста ФГБУ «ЦСП» Минздрава России «АмплиТест» перед другими наборами, зарегистрированными на рынке.

Следующий спикер, Олег Гусев, в начале выступления объяснил, каким образом Японии удалось победить COVID-19 без введения карантина и массового тестирования. Он отметил, что при подготовке ко второй волне страна ориентируется на широкое внедрение тест-систем для диагностики у постели больного. Затем Гусев рассказал о процессе создания быстрого портативного ПЦР-теста на COVID-19 российско-японской компанией «Эвотэк-Мирай Геномикс». Система основана на изотермической амплификации, транскрипция и амплификация РНК происходят в одной пробирке, время работы системы от загрузки образца до получения результата составляет 30 минут. Ноу хау разработчиков — особый способ детекции сигнала: регистрация сигнала начинается с первых циклов.

Презентация следующего докладчика, Клаудио Галли, была посвящена проблемам серологических исследований. В частности, интерпретации результатов анализов на IgG и IgM к SARS-CoV-2. Галли сделал обзор публикаций, посвященных антительному ответу при COVID-19. Он отметил, что обсуждать достоверность серологического исследования можно только в контексте цели, с которой оно проводится. Кроме того, в отсутствие референсных иммуноферментных тестов невозможно говорить о специфичности анализа на антитела к новому коронавирусу. Галли рассказал о необходимости двойного тестирования, когда для первого анализа используется тест с хорошей чувствительностью, а второй проводится по результатам первого. Он также затронул проблему определения именно нейтрализующих антител и популяционного серологического тестирования.

Татьяна Смолянова продолжила тему определения нейтрализующих антител кSARS-CoV-2. Ее команда разрабатывает иммуноглобулины для лечения COVID-19, и тесты, определяющие именно нейтрализующие антитела, были бы хорошим подспорьем в разработке. Смолянова рассказала о проверке тестов шести производителей, присутствующих на российском рынке, на образцах крови от пациентов с COVID-19, с симптомами ОРВИ и отрицательным тестом на COVID-19, от здоровых доноров, а также на препаратах иммуноглобулинов. Результаты сопоставлялись с результатами проверки вируснейтрализации стандартным методом. Лучшими тестами Смолянова назвала продукты НМИЦ Гематологии и Euroimmun.

Последний спикер, Анастасия Самсонова, рассказала о перспективах омиксных подходов к изучению новых инфекций и поиску лекарств. Эффективное использование омик стало возможно с развитием методов вычислительной биологии. Самсонова сделала обзор существующих технологий и их приложений. Так, транскриптомика раскрывает тонкости взаимодействия между патогеном и хозяином, геномика определяет факторы чувствительности хозяина к инфицированию, а клиническая протеомика может облегчить стратификацию пациентов для своевременного подбора схемы лечения. Самсонова отметила, что гетерогенная структура населения России требует детальных клинических исследований, учитывающих генетическую составляющую, при разработке эффективных вакцин и надежных диагностических тестов.

В заключение Герман Шипулин подчеркнул важность разработки быстрых диагностических тестов: сокращение времени ПЦР-анализа полностью изменит организацию ответа не только на COVID-19, но и на другие инфекции.

Полная расшифровка вебинара

Д. Горшков: Здравствуйте, дамы и господа, говорит и показывает Россия, говорит и показывает Москва. Точное московское — 10 часов 1 минута и 14 секунд. Портал PCR.news имеет честь представить проект «Специфические методы диагностики коронавирусной инфекции в России». Обращаю ваше внимание, что в правом нижнем углу вы можете выбрать нужный перевод, потому что сегодня наши спикеры вещают не только на русском, но и на английском языке.

Уже ни для кого не секрет, что ключевую роль в борьбе с коронавирусной инфекцией играет лабораторная диагностика. Именно об этом мы сегодня и поговорим. Наши спикеры находятся в Москве, Италии и по всему миру. Я представляю Германа Александровича Шипулина, заместителя генерального директора по научно-производственной деятельности «Центра стратегического планирования» ФМБА России, руководителя проекта по созданию ПЦР-тест-систем для диагностики COVID-19, он находится в Москве. Многих волнует вопрос: ПЦР показывает отрицательную составляющую на COVID, а в то же время во время КТ мы видим «матовое стекло».

Г. Шипулин: Добрый день, уважаемые коллеги и все, кто присоединился к нашему вебинару. Мой доклад будет посвящен основам молекулярной диагностики инфекции. Я на примере COVID-19 покажу, как это все работает, почему иногда получаются плохие результаты. Хотел бы начать с той картинки, которую нельзя не показать, потому что мы все пребываем в разгаре эпидемии. В мире 6 млн. 600 тыс. случаев заболеваний, 520 тыс. летальных исходов. В России 661 тыс. случаев и 9 683 летальных исхода. Очень важно оценить масштаб эпидемии. Дело в том, что эти пандемии или эпидемии никогда не прекращались. То, что COVID-19 всколыхнул нашу жизнь, не означает, что параллельно с ним не происходят другие эпидемии. Здесь данные по другим эпидемиям. COVID-19 в следующем году, надеемся, уйдет, а вот грипп и ОРВИ будут. Только по ВИЧ в мире 40 млн. случаев. От COVID-19 умерло больше 9 тыс. человек в России, но только за прошлый год от ВИЧ-инфекции в нашей стране умерло 37 тысяч человек, цифра огромная! Просто к этому мы уже адаптировались, слово не очень хорошее, но это так. Что касается таких событий, как COVID-19 — это не первое и не последнее событие. Я нашел слайд по количеству случаев и количеству погибших во время разных эпидемий, которые случались до COVID-19. Видно, что по количеству случаев это очень похоже на гонконгский грипп, с 1,5 млрд. заболевших и 500 тысяч умерших. Но в 1958 г. был т. н. «азиатский грипп» H2N2 — 1 млрд. заболевших, 3 млн. умерших. Более грандиозным событием был «испанский грипп» с 500 миллионами и до 50–100 млн. умерших. То есть, данное эпидсобытие, которое мы сейчас переживаем, оно хоть и крупное, но не самое крупное из тех, что происходили в истории человечества.

Вопрос: последнее это событие? Конечно, нет. Мы понимаем, почему это происходит. Собственно говоря, я недавно в одной статье написал, что COVID-19 легко было предсказать, потому что те тенденции, которые мы видим на этом слайде, они только развиваются. Это и объективные причины — эволюция вирусов и бактерий, природные причины, природные катаклизмы, изменение климатических условий, увеличение численности населения, интенсивные миграционные процессы, развитие туриндустрии — все это активно развивается и будет развиваться. Последние события в США и Европе показывают, что социальные катаклизмы не обходят даже т. н. «развитые страны». Все это, конечно, приводит к аналогичным событиям, которые произошли сейчас с COVID. Еще в 2014 году на TED Talks Билл Гейтс выступил с пророческим заявлением. Он очень зажигательно говорит о том, что эпидемия обязательно будет. Выступление он подготовил по итогам эпидемии Эболы. Я всем показывал и говорил, что надо готовиться к эпидемии. Гейтс, несмотря на то, что он программист, он подошел в этом выступлении с точки зрения здравого смысла и наметил некие пути — как нам подготовиться к эпидемии. Надо сказать, что его не услышали. А сейчас его стали обвинять во всем. А он говорил, что надо мониторить события, нужно пытаться предсказывать их, и в соответствии с данными предсказаний разрабатывать вакцины, лекарства и, как говорил Гейтс, «проводить учения, направленные на выработку правил, подобно военным учениям, выработку правил на противоэпидемические мероприятия».

Тема моего доклада — молекулярная диагностика, мы считаем, что методы молекулярной диагностики играют решающую роль, особенно на ранних этапах: пресловутый анализ на COVID, методы молекулярной диагностики сейчас являются основными. ПЦР и похожие методы стали основными в обнаружении случаев и стали основой для проведения противоэпидемических мероприятий. Сейчас, когда уже начали и вакцины разрабатывать, и лекарства, дальше методы молекулярной диагностики позволят, как показано на этом слайде, и мониторить эффективность терапии, прогнозировать исход заболевания. Характеризовать те штаммы, которые сейчас циркулируют, и близко к 100% проводить молекулярную диагностику случаев.

Как лучше подготовиться к эпидемии, как правильно, что нужно делать? Я здесь выделяю стратегический уровень, организационный уровень и технологический уровень. Стратегический уровень — это не тема для данного сообщения. Организационный уровень как организация пирамиды: необходимо всю лабораторную диагностику в рамках нашей страны разделить на три уровня: первичный уровень, работа с пациентами — поликлиники и ФАПы; средний уровень — уровень инфекционных больниц; уровень референс-центров — это третий. К сожалению, в настоящее время первый уровень в нашей стране как уровень первичной встречи с патогеном отсутствует, потому что отсутствуют быстрые молекулярные тесты. Это не только в нашей стране, это во всем мире. Я покажу отдельно слайды, касающиеся разработки молекулярных тестов — быстрых тестов, но надо сказать, что и во всем мире еще есть над чем работать, но в нашей стране этого уровня практически нет. Что касается срединного уровня, уровня инфекционных больниц и диагностических центров, — у нас в стране были активные события последние 20 лет, я о них расскажу.

Что касается региональных референс-центров — их нет в настоящее время в нашей стране. Я когда пришел работать в Министерство здравоохранения, в одну структуру, мы пытались создать соответствующую нормативную базу для этого, но сейчас, в связи с очередной реформой, это немножко откладывается, но понятно, что это необходимо. Те задачи, которые справа показаны — производство реагентов, экспертный уровень расшифровки, контроль качества всей лабораторной диагностики, молекулярной диагностики инфекционных заболеваний в стране — кто-то должен за это отвечать, и сейчас этого уровня нет.

Что касается молекулярной диагностики в России, что сделано на сегодняшний день: у нас создано 6–7 тыс. лабораторий, которые оснащены оборудованием для проведения ПЦР в реальном времени. У нас создана собственная отечественная база для производства реагентов для молекулярной диагностики — это Центральный НИИ эпидемиологии (ЦНИИЭ), где я работал, «Вектор-Бест», «ДНК-Технология» и несколько маленьких компаний. Кроме того, создано и создается отечественное оборудование для ПЦР. Там идет определенное отставание от того, что есть во всем мире — отсутствуют тесты для «быстрой диагностики». Но у нас есть большой парк приборов для секвенирования, что позволит заниматься в настоящее время и в дальнейшем молекулярной эпидемиологией.

Я проработал в ЦНИИЭ 27 лет, нам удалось построить самое большое производство ПЦР-тест-систем: на момент 2017 г. было произведено порядка 500 тыс. наборов, это очень много. Я позже покажу, как соотносится количество наборов и количество произведенных тестов. Поэтому, имея такой опыт за плечами, когда грянула эта эпидемия, мой институт — Центр стратегического планирования — выступил с инициативой быстрой разработки ПЦР-набора.

Кратко о том, как правильно разрабатывать молекулярные тесты для лабораторной диагностики инфекционных заболеваний на примере COVID. Необходимо выбрать область. Здесь показан геном коронавируса — область для амплификации. Мы выбрали область ORF1b, здесь показаны два синих праймера и зонд красный для амплификации. Но самое важное — чтобы эти праймеры и зонд опознавали только COVID, SARS-CoV-2, возбудителя COVID-19, и при этом не узнавали никакие другие вирусы и бактерии. Для этого нужен серьезный биоинформатический анализ. Что мы и сделали. Был выполнен элайнмент. Но не все праймеры хорошие. Понятно, что если вирус эволюционирует, накапливается мутация, то так или иначе мы столкнемся с проблемой, когда праймеры и зонды не будут выявлять какие-либо разновидности COVID. Важно быть уверенным в том, что те праймеры и зонды, которые ты выбрал, они будут долго работать, будут распознавать все варианты вируса, которые на сегодняшний день циркулируют. Мне попалась блестящая работа Осорио, она была опубликована в «Ланцете», там они взяли и проанализировали 33 пары праймеров и зондов, которые рекомендуются ВОЗ для использования. На тот момент, когда они это делали — апрель или начало мая — в геномной базе GISAID было порядка 1 825 последовательностей. И оказалось, что 79% из этих праймеров и зондов имели хотя бы одну замену в местах посадки праймеров и зондов. Однако был обнаружен ряд праймеров, которые имели замену сразу из трех букв в 3’-конце, т. е. в рабочей части праймера, которая отвечает непосредственно за взаимодействие с ДНК, за инициацию репликации. И делается вывод о том, что эти праймеры — там замена GGG на AAC. Я считаю, что это смертельно для праймера. И таких праймеров было 14% от тех, которые рекомендует ВОЗ. Эти «неработающие» праймеры были выбраны в Chinese National Institute of Viral Diseases Control and Prevention. И слева на слайде показано, что вариабельность красным — это вариабельность в местах посадки праймеров. И видно, что плохие праймеры China CDC, US CDC плохие праймеры сделали. Не всем праймерам можно доверять. Очень важно разобраться, насколько они хорошие. Поэтому мы огромное количество времени посвятили тому, что анализировать, насколько хорошие наши праймеры. После выбора праймеров мы прогнали их по базе данных, вроде все было нормально. Но буквально вчера я, когда готовился к презентации, задался вопросом: «Как же наши праймеры работают на тех вирусах, которые уже отсеквенированы и лежат в БД GISAID?». Мы взяли все российские вирусы, выложенные туда, таких оказалось 237 — из 57 тыс. всего. Хочу сказать, что буквально вчера в 11 часов вечера наш биоинформатик прислал мне утешительную новость: наши праймеры «ловят» со 100% идентичностью все варианты, которые циркулируют на территории России, за исключением какой-то пожилой женщины, которую отсеквенировали в Петербурге, и там в месте зонда, на 5’-конце, одна мутация, что не страшно, потому что зонд резистентен к мутациям, если они располагаются на концах. Поэтому мы пока можем быть уверены, что наши праймеры и зонды очень хорошо работают на российских вирусах. Вы скажете, что любой вирус SARS-CoV-2 может быть занесен из-за рубежа. Да, это может быть. Поэтому мы прогнали два наших праймера и зонда по 50 386 последовательностям. Тут показан прямой праймер, зонд и обратный праймер. Там, где написано «замена», это мутация в местах посадки праймера. В каждом положении эта последовательность праймера. Если разделить то количество мутаций, которые мы выявили в каждом из мест посадки праймеров, на 50 тыс. и умножить на 100, получится 99,99% — вероятность того, что этот сиквенс даст нам ложноотрицательный результат, крайне низкая. И такая работа должна проводиться с каждой тест-системой, с каждой парой праймеров, чтобы быть уверенными в том, что праймеры работают хорошо. Я показал, как это правильно делать.

Второй этап при разработке тест-системы — очень важно убедиться в том, что сиквенсы гетерологично не ловятся. На слайде мы видим прямой праймер, зонд, обратный праймер, а внизу видно гетерологичные сиквенсы, которые не должны ловиться. По количеству замен видно, что здесь они достаточно хорошо отличаются от SARS-CoV-2.

Следующий этап очень важен в современной разработке тест-систем — это правильное использование внутреннего контрольного образца. Я уверен, что все знают, что это такое — это специально сконструированная молекула РНК, в данном случае, которая добавляется в пробирку на первом этапе, еще в мазок. Она проходит через все этапы анализа и на конечном этапе говорит, что реакция прошла хорошо, поскольку мы ее туда специально добавили и видим, что она дала сигнал. Если она дала сигнал, значит, мы эту реакцию учитываем. Так вот, правильно добавлять РНК на самом первом этапе. Есть вариант, когда убираются праймеры и зонды на какую-либо РНК, которая экспрессируется в клетке человека. Бета-глобиновый ген, например. И это тоже вариант. Но наше мнение, что внутренний контрольный образец в тест-системе обязательно должен быть. Система без внутреннего контрольного образца — нонсенс. При разработке нашей тест-системы мы большие усилия посвятили разработке внутреннего контрольного образца и положительного контрольного образца. Здесь показана очень сложная схема, как мы это делаем. Специалисты знают, что такое MS-фаги. Суть в том, что мы берем кусок РНК из вируса SARS-COV-2 и вставляем его в последовательность РНК MS2-фага, этим самым имеем фрагмент РНК коронавируса, клонированного в MS2-фаге, который защищает РНК коронавируса от разрушения при взаимодействии с клиническим материалом. Тем самым мы получаем защищенную РНК. Эта тактика используется сейчас повсеместно, во всем мире. Поэтому современные тест-системы должны иметь внутренний контрольный образец, и он должен быть защищенным.

Следующий этап разработки тест-системы — оценка и аналитические показатели. Это делается очень сложно, но мы постарались делать это правильно. Мы измерили концентрацию внутреннего контрольного образца и положительного контрольного образца, который мы клонировали в MS2-фаг, с помощью т. н. «digital PCR». Это методика, которая позволяет делать до 20 тыс. ПЦР в одной пробирке и очень быстро набирать статистику по количественным измерениям. Таким образом, мы считаем, что наш стандарт, который мы использовали в нашей тест-системе, характеризован очень хорошо с точки зрения точности измерения. Затем серией экспериментов мы определили чувствительность, она получилась порядка 103 ГЭ/мл.

Еще очень важный этап — чтобы система не давала перекрестного результата с другими вирусами, которые живут в организме человека. И это должны быть обширные эксперименты. В условиях, в которых мы начинали разрабатывать, было непросто получить все эти гетерологичные штаммы, но вот слева таблица — перечень штаммов, которые мы испытывали, чтобы доказать специфичность нашего набора: это и коронавирус 229Е, и коронавирус ОС43, NL63, вирусы гриппа, MERS у нас был. Нужно было убедиться, что все эти вирусы представляют собой то, что они есть на самом деле, поэтому мы их получили сразу из двух источников: из Американской коллекции микроорганизмов (США) и из европейского Virus Archive — известная организация новая, недавно образовавшаяся. Достаточно оперативно удалось с ними связаться и получить необходимые РНК, чтобы доказать, что праймеры и зонды, которые мы выбрали, не дают перекрестных реакций уже в эксперименте. В результате получился набор, который мы адаптировали под три, а сейчас уже и под четыре амплифликатора — здесь не показан прибор «ДНК-Технологии». Последнее регистрационное у нас уже измененное на российский прибор ДТ-96. Таким образом, ко всем приборам на российском рынке мы адаптировали наш набор. Удалось получить не одну, а два регистрационных: вот на ручной набор показано, а еще мы разработали вариант набора под автоматическую экстракцию. Сейчас все лаборатории Москвы и Подмосковья работают с нашим набором в автоматическом формат, когда пробирка ставится на борт прибора — это Hamilton или Tecan, дальше в автоматическом режиме идет выделение РНК, раскапывание ПЦР-смеси и дальше уже ПЦР. Такой набор нами тоже был разработан.

Пришлось «построить производство с колес». Я работал в Центральном НИИ эпидемиологии, там было построено производство, долго это было, десять лет, а здесь пришлось с колес строить. Сейчас у нас 400 метров производство, вот так оно выглядит. Так выглядят наши коробки — бренд новый появился, «АмплиТест», который мы сейчас зарегистрировали. Мощность наборов, которые мы сейчас производим — порядка 100 тыс. наборов в год, все это удалось организовать за полгода работы, даже меньше. Не одни мы такие молодцы, всего было зарегистрировано 24 набора. Кроме ЦНИИЭ, «ДНК-технологии» и «Вектор-Бест» у нас, оказалось, есть еще производители. Около 20 организаций, которые их производят. Кроме ПЦР появились организации, которые впервые сделали наборы в России, и зарегистрировали их, на основе изотермической амплификации, и Олег Гусев сегодня будет рассказывать об одном из таких наборов. Мы тоже приступили к разработке такого набора.

Я посмотрел на специализированном сайте, который показывает, как обстоят дела с диагностикой во всем мире. Россия находится по абсолютному количеству тестов на 3 месте. На первом КНР, потом США, потом Россия. В день у нас за сутки делается порядка 300 тыс. исследований. Всего было выполнено 20 млн. исследований. Но по относительному количеству мы находимся не на первом месте. В Арабских Эмиратах делают 353 тыс. тестов на 1 млн. населения. Великобритания много делает. Больше, чем в России. Но мы делаем больше, чем в США.

20 млн. тестов — это много или мало? С одной стороны, достаточно. С другой стороны, ЦНИИЭ эпидемиологии в 2017 году выпускал 500 тысяч. Мощности того производства, которым я руководил, на мой взгляд, в 2 раза больше — 20 млн. тестов могла только одна организация выпускать. Потенциал у нас существенно больше. Сейчас вышло новое постановление Правительства, подписанное Мишустиным, там на закупку тестов выделяется ок. 3,5 млрд. рублей. Это надо выполнить 32 млн. тестов до мая следующего года. Понятно, что такие объемы вполне допустимы, это будет раза в полтора больше того, что сделано. Плюс еще те люди, которые продолжают выпускать тесты. Думаю, что к маю мы сделаем до 60–70 млн. тестов. Это почти половина населения страны.

Теперь самый главный вопрос, который всех интересует: какое же соответствие между ПЦР и клинической картиной? Надо сказать, что первым, кто обратил на это внимание, кто заявил о том, что что-то не так, был главный внештатный пульмонолог Минздрава Сергей Авдеев. Он сказал, что определяет точность ПЦР-тестов как 70–80%. Правда, он тут же получил ответ от известных разработчиков ПЦР-тест-систем Рудема Газиева и Александра Горелова, сотрудника ЦНИИЭ, с которым я вместе работал, что аналитическая чувствительность наших тестов — 5–10 вирусных копий. А клиническая чувствительность — 94–99%, это выше мировых стандартов. Я больше склонен доверять практикующим врачам, 70–80% — это то, что, по-видимому, видели врачи. Главное, что нет опубликованных в России исследований о соответствии между клинической картиной и ПЦР. Публикуют такие заявления «Коммерсантъ», онлайн-конференции — это не очень серьезно. Авторитет в области молекулярной диагностики у тех, кто пытался опровергнуть заявление Авдеева, отсутствует, доверять им особо нельзя. Но есть огромное количество зарубежных публикаций. Я взял одну с таким явным названием: «Негативные назофарингеальные и орофарингеальные мазки не исключают COVID-19». Авторы пишут о том, что они видят характерную картину на КТ при COVID-19, явно, что это — COVID, идет эпидемия, человек тяжело болеет, характерная «клиника», характерная симптоматика, но при этом ПЦР отрицательный. Таких публикаций, поверьте, значительное количество, сейчас и китайские пошли, и европейские. Феномен имеет место быть, есть несоответствие. 20–30% ложноотрицательных результатов ПЦР. И во второй части своего доклада я хотел бы разобраться в этом феномене и понять, что происходит.

Ключевой слайд — «Причины ложноотрицательных результатов молекулярной диагностики на COVID-19». Я вижу три основные причины:

1.     Недостаточная аналитическая чувствительность теста.

2.     Неправильное использование внутреннего контрольного образца (ВКО) или его отсутствие.

3.     Неправильное взятие клинического материала (если тест хорошо работает) или использование клинического материала, в котором нет вируса.

Важно понимать, как тесты работают. Какова аналитическая чувствительность тестов, можно понять только путем сравнения тестов. Либо проверкой тестов на контрольных материалах. У нас нет сейчас национальных контрольных материалов, поэтому каждый производитель проверяет на собственных контрольных материалах. Единственный способ понять, что же происходит — сравнить три теста. Если пациенту поставили диагноз с помощью одной тест-системы, а потом он будет протестирован с помощью другой тест-системы, эти системы имеют разную чувствительность, то он рискует получить разные результаты. В лаборатории, данные которой я привожу, сравнивались тесты «ДНК-Технологии», наш тест и тест «Амплисенс», ЦНИИЭ. Красным выделены значения, которые были получены в области низких концентраций. Видно, что тесты «ДНК-Технологии» и «АмплиТест» более-менее совпадают, тест производства ЦНИИЭ отстает по чувствительности существенно. Благодаря Росэпиднадзору ЦНИИ эпидемиологии является референс-лабораторией по тестированию для Москвы. После того, как получены данные из каких-либо коммерческих лабораторий, они обязаны послать этот мазок на подтверждение в ЦНИИЭ. Вот теперь представьте, что происходит: пациент болен, он получает положительный тест из «ДНК-Технологии», дальше этот мазок отсылают в ЦНИИ эпидемиологии, а там выдают ложноотрицательный результат! В связи с тем, что тест ЦНИИЭ менее чувствителен, чем тест «ДНК-Технологии». Понятно, что работа по сравнению тестов должна быть продолжена, нужно добиться, чтобы тесты работали более-менее с одинаковой чувствительностью. Или, по крайней мере, те люди, которые стоят у руля, знали, что нельзя подтверждать тест более чувствительный тестом менее чувствительным. Потому что пациентам будут выдаваться ложноотрицательные результаты. Вот вам одна из причин, почему иногда врачи получают ложноотрицательные результаты.

Вот еще пример. Мы взяли положительные результаты на своем тесте «АмплиТест SARS-CoV-2» и протестировали двумя другими тест-системами, «Литех» и «Вектор-Бест». Мы получили 23% дискордантный результат. То есть, те пробы, которые были положительными в нашем тесте, в «Литехе» и «Вектор-Бесте» были отрицательными. Тоже 20%. Вот еще один ответ на вопрос «Почему у пациентов с положительной клиникой на ряде тест-систем могут быть ложноотрицательные результаты». Тест обладает не той чувствительностью, недостаточной чувствительностью.

Следующая опция: неправильное использование внутреннего контрольного образца или его полное отсутствие. Это просто ужас. Я 27 лет убил на то, чтобы доказывать всем, что ВКО нужен и что его нужно правильно использовать. И вот в январе государственной структурой Роспотребнадзора «Вектор» был разработан набор. Вот копия инструкции «Вектора», здесь видите, что чувствительность теста у них — 105 копий на миллилитр. Причем не коронавирус или РНК-вирус, они здесь почему-то проверяли чувствительность на рекомбинантных плазмидах. Но самое главное, что подчеркнуто, что ложноотрицательный результат выявляется с помощью положительных контрольных образцов ПЦР. То есть не внутреннего контрольного образца, а положительных контрольных образцов, т. е. в параллельной пробирке. Но реакция в «правильной» пробирке не говорит о том, что делается в той пробирке, которая от пациента. А для этого нужен внутренний контрольный образец. Так вот, этот набор не имеет ВКО. Это привело к тому, что когда этот набор стал широко использоваться, первое, что они стали делать — выдавать ложноотрицательные результаты всем подряд, включая очень уважаемых людей. А эти люди начали протестовать. В результате было собрано совещание, я там присутствовал, мы пытались разобраться, в чем дело, и поняли, что когда в Москве были огромные потоки, лаборанты, работая вручную, не имея возможности оценивать реакцию в каждой пробирке, выдавали ложноотрицательные результаты только из-за того, что они не могли контролировать эти реакции. Реакция то проходила, то не проходила, в зависимости от обстоятельств, а внутренний контрольный образец отсутствовал. Нельзя было сказать, что происходит. Еще раз повторю: правильный способ использования ВКО — это добавлять его на первом этапе, на этапе выделения. «Вектор» — это не единственный набор, который таким образом устроен. Я вчера посчитал: порядка 37% наборов, которые зарегистрированы в России, не содержат ВКО вообще. Это значит, что если клиники будут работать с такими наборами, то они тоже могут давать ложноотрицательные результаты, потому что они просто не могут оценивать, как у них прошла реакция, хорошо или плохо. Потому что «защиты от дурака» нет, выдаются ложноотрицательные результаты, а лаборант об этом даже не знает и не может контролировать реакцию.

Вот здесь показаны наши данные. Мы взяли все отрицательные результаты по «Вектору» в одной из московских лабораторий и проставили их уже в нашей лаборатории с помощью «Вектора», а потом с помощью нашей тест-системы. Видите, что наш лаборант сработал лучше, это одна из причин дискордантных результатов, когда нет ВКО. Один лаборант дает «не обнаружено», другой — «обнаружено», и при постановке на нашем наборе мы около 10% ложноотрицательных результатов сняли. Практически в лабораториях это может быть «как Бог на душу положит», это может быть и 10%, и 20%, и 30%, в зависимости от того, какой поток. Если лаборант работает одновременно со 100 пробами, то мы видели до 40% ложноотрицательных результатов, потому что осадки он не видит, он не контролирует поток, тратит огромное количество времени на все это. ВКО нет, и непрогнозируемое количество ложноотрицательных результатов, которые лаборант может выдавать, если нет внутреннего контрольного образца.

И последнее, самое важное. Понятно, что качество тестов нужно улучшать. Оно должно быть высоким. Но даже если тест хорошо работает, значит ли это, что при данном заболевании он будет давать 99,99% чувствительности? Мое мнение, что неправильное взятие клинического материала, использование клинического материала, в котором нет вирусов, тоже очень важный фактор. Сейчас на Западе появились тесты, которые работают уже с чувствительностью, он работает с чувствительностью 200 копий на миллилитр, это один из самых чувствительных тестов.

И по поводу того клинического материала, который имеет смысл использовать. Сейчас достаточно большое количество западных публикаций о том, какой материал лучше подходит для исследования. Вот одна из публикаций: здесь показаны мазки из носа и мазки из ротоглотки. Видно, что концентрация в мазках из носа выше, особенно на первых этапах. Значит ли это, что нам надо брать мазки из носа и забыть о мазках из ротоглотки? На следующей картинке — таблица из обзора, где приведены несколько работ по сравнению двух видов клинических материалов. Нос и назофарингеальные образцы. Выясняется, что нельзя брать только мазки из носа. В работе Беллингера были материалы, которые были «положительными» и в носу, и в носоглотке, но при этом были образцы, которые в носу были отрицательными, а в носоглотке — положительными. В работе Базу (последняя строчка) видно, что было 17 пациентов «положительных» назофарингеальных, а в носу были отрицательными. Получается, что только мазки из носа недостаточны. Я хочу сказать, что вообще мазки из носа — отдельная история. Инструкция говорит о том, что нужно обязательно из обеих ноздрей и, как минимум, 10 секунд держать зонд в носу, это очень важно. Иначе будет недостаточное количество материала. Получается, что мазки из носа — это не панацея, обязательно нужно лезть в глотку. Разница между носоглоткой и ротоглоткой не очень большая, видно на картинке. Получается, что, если мы лезем в нос — это одна полость. Если мы лезем через нос в носоглотку, по сути, мы забираем из глотки, которая является частью ротоглотки. Но при этом, когда зонд вытаскиваем, еще и из носа забираем. Получается, что когда берем из носоглотки, из двух частей берем: из носа и из глотки. Вы скажете: почему же мы не можем брать только из носоглотки, зачем нам в ротоглотку лезть? Да потому что технически и психологически из носоглотки брать не очень приятно. Должен быть специальный зонд. Огромный дефицит зондов был в марте-апреле. Не то, что изогнутых, у нас обычных зондов не было. Промышленность не справлялась, поэтому использовали прямые зонды, а ими не возьмешь из носоглотки. Нужен был специальный зонд. Поэтому стали брать из носа, из ротоглотки. Правильно это, неправильно? Если мы берем только из носа — информативность 63%, у вас почти 40% ложноотрицательных результатов. Если из ротоглотки — 32%. Данные Wang. Получается, что нос более информативен, чем ротоглотка. Но понятно, что и из носа недостаточно и из ротоглотки недостаточно, нужно брать из двух «источников».

Еще один вид клинического материала, мой любимый. Почему? В 2003 году, когда была эпидемия тяжелых ОРВИ в Китае, нам удалось поработать в Военно-медицинской Академии Министерства Обороны КНР в Пекине. Статья «Разработка и апробация тест-системы для выявления РНК вируса, вызывающего тяжелый острый респираторный синдром» 2004 года. Я очень горжусь этой статьей, потому что мы работали вместе с китайцами и была показана та же самая история: что если брать мазки из носоглотки, ротоглотки, чувствительность теста недостаточна. Нужно брать еще откуда-то. И я предложил тогда брать фекалии. Почему? Потому что у большинства пациентов с ТОРСом на тот момент наблюдалось поражение ЖКТ. И когда мы объединили два вида клинического материала, тестировали параллельно мазки из носоглотки и брали фекалии, а потом эти данные объединяли, у нас чувствительность получалась 95%. Если мы тестировали только мазки из носоглотки, чувствительность была 40%. Было опубликовано несколько западных статей, где было показано, что даже у лучших западных тестов чувствительность была не больше 50%. Получается, что выбор клинического материала играет даже большую роль, чем качество системы. Если вы берете из места, где концентрация вируса незначительная, никакая чувствительность вас не спасет, надо искать другой клинический материал.

Я специально взял обзор статьи, где приводятся данные по тому, что дают фекалии в случае COVID-19. Известно, что у 79% с COVID-19 имеются симптомы поражения ЖКТ. И в таблице приводятся данные, которые говорят о том, что имеет смысл тестировать фекалии, чтобы увеличить диагностическую чувствительность теста на COVID. Вы видите, что пациентов с положительным фекальным тестом до 35–53% — фекалии работают почти так же, как ротоглотка. Но если мы добавляем эти данные к данным о назофарингеальным мазкам, то мы получаем вклад до 80% добавления в чувствительность. Тем самым мы выходим на ту чувствительность, которую мне удалось получить в Китае. Мы получили чувствительность 95% только объединением двух видов клинического материала. То есть, одного вида клинического материала недостаточно.

Я предполагаю, что в случае с COVID-19 та же самая история: какой бы чувствительный тест мы не использовали, все равно у нас будут пациенты, у которых концентрация вируса в носу низкая. Я не привожу еще одну работу, где показано, что даже на Abbott Molecular, одном из самых высокочувствительных тестов сейчас — 200 копий на мл — когда они берут из носа, они обнаружили, что если концентрация вируса 103/мл, то Abbott работает воспроизводимо. Как только у пациента становится ниже 103/мл, начинается невоспроизводимость. Поменьше засунули зонд, и уже возникает невоспроизводимость. Поэтому, конечно, нам не достаточно только одного материала для достоверной диагностики.

Мой авторский взгляд на то, как правильно забирать материал: концентрация вируса в верхних отделах дыхательного тракта бывает недостаточной для того, чтобы с чувствительностью 99% поставить диагноз. Но отсюда следует, что необходимо следующая идеальная схема: забор материала из носоглотки, ротоглотки и фекалии, либо нос-ротоглотка и фекалии. Нос и носоглотка, если будет добавлена ротоглотка, будет работать приблизительно одинаково. Плюс обязательно фекалии. Эту схему тяжело на практике осуществить, особенно когда было много пациентов, большое количество материала нужно обследовать. Поэтому альтернативная схема: дублирование взятия мазков из носа и ротоглотки у пациентов с легким течением инфекции, а если это тяжелое течение, то обязательно мокрота, это самый лучший материал, он должен давать высокую чувствительность сам по себе. Но если мокроту/БАЛ тяжело взять, то — нос, ротоглотка и обязательно фекалии. Конечно, эту схему нужно еще протестировать.

Что у нас с рекомендациями Минздрава? Здесь показана седьмая версия, опубликованная на сайте Минздрава. Кроме того, что я сказал, это еще цельная кровь, сыворотка и моча. Все данные показывают, что в моче не удается обнаружить вирус вообще, неинформативный материал. В цельной крови и сыворотке — это разовые находки, никакой диагностической информативности тоже нет, это нужно убрать. Остальное нужно более аккуратно расписать.

И теперь хочу рассказать о быстрых тестах. О своем опыте. На Западе сейчас появился целый ряд приборов и тестов для быстрой диагностики. Я покажу самые яркие из них. GenMarkDx — за час он делает 70 тестов параллельно, на 70 патогенов. В одном картридже. Для диагностики маркеров сепсиса. Конечно, это мечта, особенно для реанимации. Когда такие приборы будут появляться, будет замечательно.

Таблица показывает, какие тесты были зарегистрированы за рубежом. Здесь не все, только часть. Среди них два быстрых теста, один — компании Abbott, технология NEAR. Она позволяет проводить анализ за 15 минут. ПЦР сейчас идет 3 часа, здесь — 15 минут. Компания уже выпускает такие тесты.

Недавно появился тест SHERLOCK на основе Cas13a — всего полтора часа. Но он существенно проигрывает. Тем, кто пытается сейчас что-то разработать на Cas13a, нужно подумать об ускорении этого.

Здесь вот перечислены альтернативные методы амплификации. Мы за год в Центре стратегического планирования перепробовали половину из них. Кроме NEAR. Мы пробовали HDA, TMA, LAMP. К сожалению, все они не очень хорошо работают. Кроме LAMP. Он мне не очень нравится, но пришлось пойти по его пути, потому что он очень хорошо работает. У него очень сложная реакция, приходится выбирать 6 праймеров, 4 базовых и два дополнительных. Для двух-то праймеров тяжело найти места, где бы не было мутации, а здесь 6! И нужно гарантированно быть уверенным в том, что эти праймеры не лягут туда, где у вируса мутация.

Чем наш тест отличается от остальных, зарегистрированных на рынке? Во-первых, есть внутренний контрольный образец. Во-вторых, он с зондом, не со специфическим красителем. Мы смогли найти место, куда можно положить ФМ-зонд, причем зонд лежит и на ВКО и на ПКО. Сейчас мы получаем результаты уже за 10 минут. Но пока дожидаемся 30, потому что низкие пробы выходят при 30. Сейчас мы работаем над совершенствованием фермента, надеемся, что в ближайшее время перейдем на реакцию, которая, как и NEAR, будет идти за 15 минут. И следующее, это быстрый метод выделения, без которого невозможно.

На этом у меня все, спасибо за внимание.

Д. Горшков: Краткий итог: что фекалии и мокрота – это «наше все»!

Г. Шипулин: Когда мы свой набор зарегистрировали, мы туда включили фекалии. Ни одна лаборатория не использовала наш набор для тестирования фекалий. Они не популярны, хотя есть большое количество статей, показывающих, что они добавляют чувствительность. Но в качестве материала для тестирования они не популярны — неудобно работать и т. д. Не вошло в моду. До сих пор в мире и в России тестируют либо мазки из носа и ротоглотки, либо просто из носа, с нарушением, потому что это недостаточно, нужно брать из носа и ротоглотки как минимум. Но, если вы хотите добиться чувствительности 99%, а не 70%, как говорит Авдеев, нужно обязательно подключать и фекалии. Это мое авторское мнение.

Д. Горшков: Правильно ли я понял, что внутренний контрольный образец существует не во всех тестах?

Г. Шипулин: Да. Я показал около 37% наборов, которые зарегистрированы в России, они не имеют внутренний контрольный образец сейчас.

Д. Горшков: И поэтому такое количество разногласий происходит у пациентов, у врачей и родственников — они не понимают, почему?

Г. Шипулин: Да, в том числе.

Д. Горшков: Большое спасибо! Мы перелетаем из Москвы в Казань, где находится Олег Гусев. Тема доклада «Японско-российские технологии компании “Эвотэк-Мирай Геномикс” для экспресс-диагностики коронавирусной инфекции в формате Point of Care Testing». Заведующий лабораторией RIKEN, Япония. Научно-клинический центр прецизионной и регенеративной медицины, Олег Гусев, Казань. Здравствуйте!

О. Гусев: Добрый день, коллеги! Я на связи с вами из Токио. Большое спасибо за классную организацию мероприятия. Мы с Германом давние идейные партнеры в разных областях, начиная с геномики человека и заканчивая ПЦР-тестами. Сегодня я, будучи научным сотрудником, в первую очередь, расскажу о некоторой научной подоплеке того, что лежит в основе быстрых ПЦР-тестов с конкретными примерами.

Благодаря предыдущему докладчику очень многое уже раскрыто, мне будет гораздо легче уложиться в отведенное время.

Я являюсь сотрудником Казанского федерального университета, но уже около 5 лет на территории одного из ведущих институтов Японии RIKEN есть представительство, совместная российско-японская лаборатория, где мы учимся и ведем совместные исследования, смотрим на лучшие технологии, которые можно применить для повседневных нужд двух стран. Такая активность не остается незамеченной, в том числе, со стороны правительства Японии. Можно сказать, что за последние несколько лет, благодаря такому партнерству, были инициированы и проведены несколько очень интересных больших исследований по наследственным онкозаболеваниям, созданию альтернативного регистра доноров костного мозга.

Но сегодня я бы хотел поговорить о еще одном примере. Мотиваций у меня здесь две как у ученого. Первая: сейчас часто бытует мнение, что ПЦР-тесты обладают 50–60% чувствительностью, «либо встретишь динозавра, либо нет». И я хотел бы это опровергнуть. И второе: зачастую даже профессиональные издания говорят, что было удивительно, что ПЦР-тесты — это долго и надежно, а «экспресс» — это что-то связанное с антителами, быстрое и не очень надежное. В своем докладе я бы хотел показать пример гибрида, где все быстро и надежно.

Картинка — это статистика на вчерашний день. Я живу в Японии в префектуре Ибараки с населением почти 3 млн. Япония первая после Китая приняла на себя удар вируса, было много неблагоприятных прогнозов. За почти полгода общее число заболевших во всей префектуре составило 176 человек, из них 10 смертей. И впервые за три недели было выделено 2 новых случая на 02.07.2020. Префектура находится совсем рядом с Токио, огромный поток людей приезжает в Токио и возвращается оттуда. Казалось бы, эпидемиологическая ситуация должна быть неблагоприятна. Но на самом деле сейчас общепринятое сочетание «загадочное спасение», что Япония без массового тестирования и без карантина победила эпидемию COVID. Есть чуть ли не 40 разных гипотез, начиная от культурных особенностей, от культуры ношения масок, и заканчивая генетическими аспектами. Но то, в чем сходятся все эксперты — это то, что в Японии очень мощно поставлена система отслеживания респираторных вирусных заболеваний с максимальным вовлечением дифференциальной диагностики. Это значит, что один из аспектов того, почему Япония очень эффективно локализовала эпидемию, несмотря на низкое количество проведенных ПЦР-тестов — это то, что на конкретный анализ попадали далеко не все люди с признаками респираторных вирусных заболеваний. Например, мэрия Москвы издала указ, что все люди с признаками ОРВИ должны проходить тестирование на COVID-19. В Японии существует своя система — это система мониторинга распространения гриппа, туберкулеза и др. инфекционных заболеваний. В большинстве больниц, когда человек приходит на осмотр с признаками ОРВИ, тут же ставится мобильный экспресс-тест на грипп. И на несколько ключевых вирусных заболеваний. И этим отсекается большое количество потенциальных кандидатов на дальнейшую логистику. Это делается очень организованно. При проявлении заболевшего он сразу не допускается на рабочее место, он обязан оповестить работодателя. У нас в институте регулярно циркулируют новости о том, сколько было заболевших гриппом и в каком подразделении. Это срабатывает очень хорошо. И сейчас страна ориентируется на более мощное, глубокое внедрение именно систем т. н. «у постели пациента», ожидая вторую волну.

Теперь поговорим о диагностике COVID-19, его носителей. Когда мы говорим про чувствительность и специфичность, всегда считается, что «золотым стандартом» является ПЦР, чувствительность и специфичность у него в районе 100%, а иммунологические тесты, иммуноферментные обладают меньшими показателями. Но, думая о времени теста, — именно такие тесты на антитела быстрые. А то, что связано с ПЦР — нужна лаборатория, долго, от сдачи материала до получения результата проходит несколько дней. И наши индустриальные партнеры, которые выразили интерес к такой разработке, объединили скорость таких быстрых иммунологических тестов с точностью ПЦР. И так родилось решение, которое является ПЦР-решением, но детектирует полный процесс: от забора материала до получения результата составляет менее 30 минут. Кроме того, система получилась портативной, и даже без специализированной лаборатории ее можно развернуть и использовать. Когда спрашивают: когда же компания успела подготовиться и очень быстро вывела на рынок такой интересный продукт? Дело в том, что сотрудничество японского института и двух индустриальных партнеров, включая российских, началось гораздо раньше. Это сотрудничество является одним из пунктов большой программы сотрудничества Японии и России в области медицины и улучшения качества жизни населения. Оно идет с 2018 года, изначальный ориентир был на менее вирулентные и опасные заболевания, в частности, на грипп. Получилась очень интересная комбинация: японская научная сторона предоставила протоколы, реагентики, биохимическую часть, а российская команда использовала свои очень хорошие навыки и создала инженерные решения — портативную лабораторию. Поэтому появилось интересное законченное решение.

Когда сегодня обсуждалась проблема этих ложноотрицательных результатов и плохой чувствительности, я вспомнил этот слайд и хотел бы немного на нем остановиться. Классический ПЦР, который делается в лаборатории, включает несколько неизбежных этапов. Существуют чисто логистические сложности: РНК сначала нужно выделить, на это нужно время; потом ее нужно перенести, чтобы сделать комплементарную кДНК — это тоже время, и сама амплификация и детекция. Кроме пунктов про забор материала, качество теста — эти аспекты уже были озвучены — не стоит забывать, что часто эти этапы происходят в разных комнатах, в разных пробирках, а иногда и разными руками, это потенциальные источники проблем. И на каждом этапе мы можем ожидать сбой. Например, многие лаборатории, которые переключились на работу с COVID, до этого времени имели опыт работы исключительно с ДНК-вирусами, тогда как COVID — это РНК-вирус. Работа с ДНК и РНК — это абсолютно разные вещи.

И в решении, которое создала российско-японская команда, эта система SmartAmp, это изотермальная амплификация, которая использует сложную комбинацию праймеров. При грамотном подходе, а метод SmartAmp был разработан в Японии, это усовершенствованная версия LAMP-амплификации, про которую сегодня уже упоминали. Она была создана как улучшенная версия с основной целью, кроме термальной амплификации самой по себе, иметь возможность детектировать генотип. И пациента и вируса. Использовать одновременно точечные мутации. Одно из интересных преимущество системы — что в общую процедуру до 20–30 минут включено и выделение РНК, и транскрипция, и амплификация РНК до конечного продукта. И эти два пункта — транскрипция и амплификация — объединены в одну пробирку, в один временной промежуток. Это возможно, т. к. все эти процессы происходят при одной и той же температуре — 67°C. Очень удачно были проведены большие биоинформатические исследования, был выбран один из самых консервативных регионов, и сейчас еженедельно производится мониторинг на наличие новых штаммов, чтобы смотреть, насколько система точна.

Таким образом, снижение количества времени и снижение этих шагов, где может произойти ошибка, дает нам очень интересное и очень понятное решение.

Второй пункт, почему можно получить хорошую скорость и хорошую детекцию, это некое ноу хау нашего института RIKEN — особый способ детекции сигналов. Здесь используются т. н. экситон-праймеры, которые присоединяются непосредственно к молекулярным затравкам, т.е. к праймерам. Особенности от других подходов к детекции в том, что флюоресценция начинается в тот момент, когда праймер находит свою цель. То есть, первый цикл амплификации тут же начинает производить сигнал, который можно детектировать. Это означает то, что, по сути дела, амплификация сопряжена с получением сигнала, т. е. с первых циклов в одной пробирке РНК конвертируется в кДНК, тут же начинается амплификация сигнала, и тут же мы получаем первые признаки сигнала. За счет этого скорость снижается, и за ограниченный период времени 20–30 минут мы получаем сигнал такой силы, что зачастую можем даже визуально наблюдать, без специализированного прибора. Это тоже одно из привлекательных решений.

Мы как ученые используем это для ряда проектов, эта технология не специально сделанная под инфекционные заболевания. Например, один из наших проектов — диагностика онкологии прямо во время операции, когда нужно принять решение.

То есть, если мы просто посмотрим сравнение системы SmartAmp, которая используется в этой диагностической системе, мы видим, что при сопоставимой чувствительности и специфичности лабораторным методом, здесь имеется ряд преимуществ, в том числе упрощение техтребований для приборов детекции, а так же возможность детектировать однонуклеотидные замены. И все это происходит при постоянной температуре, что очень хорошо помогает.

Индустриальные партнеры сделали очень интересное решение. Оно качественно отличается от абсолютного большинства тестов, которые в России доступны, потому что предоставляется мобильная лаборатория, достаточно упрощенная, в которой даже непрофессиональный оператор с навыками лабораторной работы может производить как экстракцию ДНК, так и амплификацию с детекцией сигнала, и все это укладывается в 30 минут. И так же отдельно поставляются реагенты для клинических лабораторий, на том же самом реагенте. Даже при существующем ПЦР-парке возможно ее использовать.

Именно эта система одной из первых была включена в ОМС в Японии, т. е. она покрывается национальной страховкой, ее апробация проводилась на образцах, которые были получены от пациентов с «Diamond Princess», потому что образцы привлекли огромное внимание, они были аналитически разобраны на маленькие кусочки, и именно они использовались для анализа. Мы видим, что даже 100 копий поднимается на реакцию за 20–25 минут. Стабильный предел детекции был примерно 20 копий на реакцию, но для гарантии результата этот порог чувствительности был немного сдвинут, чтобы конечный пользователь мог себя хорошо в этом чувствовать.

Тем не менее, несмотря на то, что решение это очень интересное, сейчас широко используются эти мобильные системы, все равно это некоторое антикризисное решение. Оно включает в себя пипетирование, и есть этапы, где конечный пользователь может чувствовать себя неуверенно, особенно без профессиональной подготовки. И основной целью российско-японской разработки в ближайшем будущем (по секрету — вероятно, в этом году) — это полностью POCT-решение в формате как в кабинете врача, так и дома. Полностью исключена необходимость использования пипеток, каких-то таких отдельных шагов, и будет реализован в виде отдельных картриджей. Наверное, самое близкое к тому, что Герман сегодня показывал как решение компании Abbott, но с чувствительностью и специфичностью лабораторных тестов.

Проиллюстрирую вам необходимость и эффективность этого подхода. Так как прототип этого девайса, ориентированный на грипп, был готов уже в прошлом году, то в рамках научных исследований в Москве на платформе двух больниц было проведено научное исследование специалистами RIKEN и российскими специалистами, которые использовали прототип этих тестов для того, чтобы посмотреть, как это будет входить в рутинную практику. Идея была такая, что в потоке пациентов в том же кабинете находилась команда исследователей, которым предоставлялись образцы мазков. Доктор ставил свой диагноз по наличию отсутствия вируса гриппа, и это подтверждалось или не подтверждалось молекулярным тестом. Это было актуально. У нас в стране существует уверенность, что массовая вакцинация является панацеей. Если человек привит от гриппа, то он уже не будет болеть. И второе — то, что наши замечательные врачи могут на глаз поставить правильный диагноз. Сейчас стало очевидно, что точная диагностика — это суперактуально, это было подтверждено такими результатами. Всего было исследовано 128 пациентов. Врач симптоматично ставил диагноз, писал, какие случаи он считает гриппом, а какие нет. И параллельно система за 15–20 минут детектировала носитель, и данные сопоставляли. И что оказалось? Что среди половины «положительных» пациентов, кому врач давал заключение о гриппе и соответствующие рекомендации, гриппа не было. Как диагноз, так и назначение лекарств проводилось зря, потому что касалось каждого второго из тех, кого врачи считали носителями гриппа. С другой стороны, из 106 пациентов «отрицательных», как минимум у четверти из них на самом деле был конкретный грипп. Сначала врачи относились к этому крайне скептично, но буквально через 3–4 дня после начала уже пошел поток, потому что врачам крайне интересно было знать второе аналитическое мнение. Был ряд примеров. Самый показательный — это когда врач, проводящий прием, у него было легкое недомогание, он сказал, что, поскольку он сделал прививку, заболеть он не может. И через день слег с температурой 40. А второй случай — у водителя «скорой» с небольшими признаками ОРЗ диагностика подтвердила грипп. Через два дня человек слег с высокой температурой. И этот эффект от помощи системы, как сильно она помогает, перевела на нашу сторону, сторону ученых, персонал больниц полностью.

Аналитика показала, что среди потока пациентов такая диагностическая система выделяет количество реальных носителей гриппа сопоставимо с эпидемиологическими исследованиями, которые проводит Институт гриппа, получаются те же проценты. Но, если бы использовалась не ПЦР-диагностика, не анализ на вирус, а если бы использовался иммуноферментный анализ на антитела, то количество вирусов у большого количества пациентов было такое низкое, что было очевидно, что антител там еще нет. И это опять бы дало ложно-негативные результаты. То есть, это крайне интересное свидетельство того, что именно ПЦР-диагностика «у постели пациента», в кабинете врача, должна быть близко реализуемой целью.

И еще я хотел сказать, что во всем мире к этому идут. Что для постпандемии, когда первая волна пандемии пройдет, когда станет необходимо думать и контролировать вторую волну, здесь решением, на мой взгляд, должно быть не массовое тестирование, которое нужно делать без остановки до следующего года, а активное внедрение таких мобильных диагностических решений, чтобы каждый пациент получал точную диагностику. Инженерное решение компании EMG позволяет интегрировать в один чип идентификацию гриппа и COVID-19, они сопоставимы с лабораторными тестами, и именно на местах в эпидемиологической динамике быстро пропускать через диагностику всех подозрительных с ОРВИ пациентов. Строить карту реального времени по очередным вспышкам заболевания, как гриппа, так и COVID-19. И особенно приятно, что научно-техническое российско-японское взаимодействие позволяет это делать. Можно сказать, что система, которая получена, не уступает зарубежным аналогам. Это один из первых прецедентов в России. Спасибо за внимание!

Д. Горшков: Олег, одна из наших зрительниц, Мария, спрашивает: на Вашем слайде указана чувствительность от 100 копий, но не указано, в чем такая чувствительность проявляется. Можно подробнее?

О. Гусев: Речь идет от 100 копий на реакцию, а это означает 1 000 копий на миллилитр. Или от 100 копий в реакции, когда у нас в пробирке присутствует 100 и больше копий вируса, система работает со 100% чувствительностью.

Д. Горшков: А сколько примерно стоит проведение такого теста, финансово?

О. Гусев: Я не знаю. Я со стороны науки говорю. Вопрос к разработчикам и к маркетингу. Но я могу сказать, что это ниже, чем сопоставимая цена лабораторных тестов за рубежом. И кажется, это примерно в том же ценовом диапазоне, что и тесты, которые сейчас доступны в России. Это должно быть немного дороже, потому что оно включает в себя большее количество праймеров и некое инженерное решение, но то, что мы знаем — это полностью сопоставимо, по сравнению с ценой, которую выставляют компании для диагностики. Но точно я не могу сказать.

Д. Горшков: Герман Александрович приводил пример тех пандемий, которые были 60–100 лет назад. Если бы те пандемии были сейчас, была бы самоизоляция, современные методы исследования, то какое количество людей выжило в те годы?

О. Гусев: Я не смогу точно ответить, не будучи генетиком, а будучи молекулярным биологом. Но знаю, что были аналитические прогнозы о том, что если бы вообще не было никакой системы, если бы Япония не использовала такие научные подходы, то количество жертв было бы выше в сотни раз, с учетом плотности населения. И возрастного населения. И это мое личное мнение.

Д. Горшков: Теперь мы переместимся в Италию, где нас ждет Клаудио Галли, он расскажет о проблемах и возможностях серологических анализов SARS-CoV-2. Он представляет компанию Global Associate Medical директор «Abbott Laboratories». Добрый день, господин Галли.

К. Галли: Отлично. Большое спасибо за перевод, я смог послушать прекрасные презентации, которые уже прозвучали. Сегодня мы работаем с темой, которая называется «диагностика». Я очень высоко ценю ту подробную информацию, которую вы здесь представили, я очень много узнал о молекулярном тестировании, и хотел добавить несколько вещей, которые, может быть, будут более общего интереса.

Инфекционность начинается до проявления симптомов, и это — одна из причин того, почему инфекция распространялась и распространяется так быстро. Я слышал новости из США, из Израиля, где пошло повышение заражения. Барьерные защитные меры будут играть огромную роль. Мне очень понравился слайд Германа об уровне тестирования в этом году и тестировании РНК с численностью населения. Конечно, в более общих чертах можно волноваться о том, что происходит в Индии, потому что мы видим, что уровень тестирования на миллионы жителей там очень низкий. Соответственно, мы можем быть уверены в том, что там в 8–10 раз больше случаев, чем мы считаем.

Совершенно не удивительно, что у нас возникает повышение. И только в первую часть возникновения инфекции или заболевания это происходит. Здесь есть сильное несоответствие между тестированием и положительными результатами РНК в поздних стадиях, и изоляцией вируса. На самом деле, мы все понимаем, что на 180 градусов недавно ВОЗ развернула свою позицию. И совсем недавно изъяла свое заявление, что наличие положительного результата РНК-теста совершенно ничего не означает на более поздних этапах. Попробуем ввести это в контекст.

РНК-техника имеет несколько неудобств, Герман их очень хорошо описал. Одно из них было — какой именно образец вы забираете для анализа. Это важно. Если бы людей могли тестировать больше по фекалиям, то, конечно, положительных случаев было бы обнаружено значительно больше.

Когда мы переходим к более поздним этапам, а это — правая часть нашего графика, мы видим, что менее вероятно, что возникнут дальнейшие положительные результаты с РНК. Потому что контент объема РНК в образце, содержание, значительно меньше на этом этапе. И на более поздних этапах содержание меньше, чем в начале. Однако что беспокоит? Не все РНК, которые обнаруживаются, реплицируются. И мы называем это «вирусной нагрузкой», но это не она. Здесь мы говорим об общем явлении. И здесь нам нужно продумать, как мы будем сочетать тесты с тем, в чем у нас есть потребность. Именно это я постараюсь сейчас рассказать.

Когда мы смотрим с позиции диагностики, мы видим, что срочно необходимо привлечь внимание к дополнительной роли серологического анализа. Серология всегда противоречива. Мы все были удивлены достаточно неважными результатами этих исследований в начале их появления на рынке, потому что делались они быстро, это все были экспресс-тесты со своими ограничениями, методология не всегда качественно соблюдалась, поэтому возник большой вопрос: насколько полезно серологическое исследование в целом. Сейчас у нас уже есть другие возможности. У нас есть лабораторные исследования, которые значительно надежнее, но по-прежнему достаточно большая устойчивость использования этих тестов. Как лучше всего их использовать? Если говорить о том, что в общем может происходить, я представлю вам сейчас теоретический слайд. На начальных этапах нам нужно будет найти вирусные биомаркеры, например, вирусную РНК. Далее мы переходим к более продвинутым острым стадиям. Мы видим, что сначала у нас должен быть IgM в течение недлительного периода, и IgG, более длительно персистирующий у хозяина. Но насколько долго будет персистировать IgG у хозяина, мы пока на этом этапе еще не знаем. Это будет интересно и со стороны защиты хозяина, и со стороны обеспечения долгосрочной иммунной защиты. Но принципиально здесь то, что эта инфекция, в отличие от других вирусных инфекций, имеет очень много пересечений с ранним ответом IgG и IgM, и это подводит нас к таким примерам: это примеры из статей, которые публиковались по самым разным исследованиям. В данном случае мы видим очень нескоординированные картины, и в большинстве случаев, как кажется, у нас мутации происходят одновременно. В последнем случае мы совершенно точно видим более ранний ответ и более высокий. Как правило, это подтверждается, но не всегда. Я думаю, что все вы это видели, это одна из диаграмм, которая показывает различие в раннем ответе IgG и IgM сероконверсий. Мы видим, что, с одной стороны, у нас сначала появляется IgG — справа, а с другой стороны — IgM возникает сначала, левый пример. В реальности различие не так велико. Если принять во внимание некоторые исследования, которые охватывали большой процент населения — вот здесь почти 300 человек исследовали — мы увидим, что оба ответа начали обнаруживаться после нескольких дней от начала заболевания. Дошли к пику они через две недели. В течение двух недель аккумулировалась вся симптоматика, при этом не все симптомы были налицо, это было ограничением обоих исследований. И вместе с тем гораздо более высокий уровень у нас положительных результатов IgG, чем IgM.

Большинство статей, которые мы изучаем, возникают в Юго-Восточной Азии, причина очевидна. Две когорты людей: одна с положительным диагнозом по ПЦР, а другая группа ПЦР-негативная. Но в обоих примерах мы видим, что уровень положительности у IgG выше, чем у IgM. Это не означает, что IgM не имеет никакого <…> этапах нам сильно поможет. Это может быть биомаркер для стадирования, если хотите, который дает возможность оценить, есть ли инфекция у людей с негативной РНК. Тогда это имеет значение. В частности, он сообщит нам о том, когда была приобретена инфекция.

Далее серологический анализ сообщает нам, о каких антигенах мы здесь говорим. Здесь нам предстоит сделать выбор между двумя принципиальными вариантами: нуклеопротеин N и рецептор-связывающий домен S. На начальном этапе мы понимаем, что ответ на нуклеопротеин N значительно вероятнее, потому что нуклеопротеин здесь выраженнее. Здесь мы видим более высокий и более низкий ответ и более сильный и более слабый. Здесь есть и различия. Слева у нас люди с тяжелыми случаями, ответ здесь значительно более сильный, а справа люди с менее проявленными заболеваниями, с более умеренным ответом со стороны иммунной системы. Значит, мы задаемся вопросом: когда вы отправляетесь в популяцию, где очень мало симптомов проявлено, очень вероятно, что по антителам будет негативный результат безотносительно того, какой тест на антитела вы используете. Если вы хотите посмотреть с другой стороны, и мы знаем, что большой объем заболеваний возникает в связи с сильной иммунной реакцией на вирус, возникает воспалительный процесс, который затрудняет работу оболочки, и мы знаем, что воспалительные факторы имеют огромную роль для распространения этого заболевания. То, что изначально считалось тяжелой пневмонией, на самом деле оказывается чем-то другим, и микрососудистые заболевания тоже играют огромную роль.

Давайте мы скажем, что людям всегда важно, насколько чувствителен анализ для целей скрининга, диагностики и, возможно, мониторинга ведения. У нас есть доказательные данные. Я смогу рассказать о том, как это делается. Обычно рассчитывается количество дней после ответа и количество дней после первого положительного результата ПЦР-анализа. Вот здесь было проведено более 100 тестов по образцам в рутинном режиме и был обнаружен вот такой уровень положительных ответов IgG. Это где-то 200% через две недели после наступления заболевания. Теперь сравним с положительными результатами: видите, что «положительность» растет и проявления наступили после наступления симптоматики. Это важно, потому что здесь у нас генерируются разные ответы. Посмотрим, насколько данные отличают клиническое стадирование или количество времени, которое прошло постановки ПЦР.

Теперь вопрос: достаточно ли это хорошо? Ответ: все очень сильно зависит от вашей цели. Давайте, мы посмотрим, что такое чувствительность, как она связана, с чем она связана, особенно в негативном прогностическом значении. Мы знаем о взаимоотношениях между чувствительностью определенной тест-системы и распространенностью инфекции в определенной популяции. Так же мы знаем, данные были опубликованы в ряде статей, о том, что практически все они доходят до 90% чувствительности через две и больше недели от начала заболевания. То есть, существующие иммуноферментные тесты и полностью автоматизированные тест-системы имеют чувствительность, которая выше на 90% на образцах, если прошло больше 2 недель с начала заболевания. Что теперь надо сказать? Все это очень сильно зависит от того, зачем используется тест-система. С какой целью проводится тестирование? И с какой популяцией вы работаете. Возьмем пример: среднее население, которое попадает под инфекцию. Если мы предполагаем, что, действительно, от 5% до 25% распространенность у определенного населения, то в особо пораженных случаях уровень положительности будет больше 30%, то тогда вероятность ложноотрицательного результата достаточно низкая. Задавали вопрос: если у нас отрицательная ПЦР и при этом «матовое стекло», которое предполагает, что пневмония, действительно, может быть и она может быть отнесена к SARS и к COVID, вместе? Здесь очень важна лабораторная диагностика, потому что это как раз те случаи, когда клиническое суждение вместе с качественной визуализацией и лабораторными данными, действительно, поможет. Нет никакого простого решения. У нас нет инструмента, который дает 100% уверенность, поэтому нам надо максимально сопоставлять результаты. Но чувствительность очень важна, если вы хотите работать с этим аспектом по диагностике. Но есть и другая важная тема, чем больше мы движемся дальше, тем более актуальной она будет. Это специфичность. Мы все знаем, что основные ограничения исходных тестов, которые были доступны по специфичности, удовлетворяли, всем нравилось 90–95% специфичности, которые якобы дают, и они довольно удобные. Достаточно ли этого? Зависит от того, для чего вы будете это использовать. Посмотрим данные, они взяты из той же статьи, откуда взяты данные по чувствительности. Если дойти до такого уровня специфичности с таким уровнем распределения, что хорошо, потому что отрицательные числа у нас здесь очень далеки от порога, вы будете уверены, вам будет довольно комфортно с положительными данными, которые вы здесь получаете. Но у вас не будет 100% уверенности. Я беспокоюсь по поводу того, что когда люди видят такие цифры, или чувствительность 100% через две недели или чуть меньше, они считают, что это — абсолютное значение. Нет. Любые значения в любой популяции всегда имеют определенный интервал доверия. Когда вы тестируете тысячи человек, у вас получается очень твердый расчет, большие цифры. Но когда вы тестируете несколько сотен, интервал доверия обязательно должен быть использован. Обращайте на это внимание, это важно. В каком-то конкретном случае людям может показаться, что один тест более чувствителен, чем другой. Но если посмотреть на интервал доверия, и этот интервал пересекается между двумя тестами, которые, как кажется, похожи, то это очень важная информация.

Итак, специфичность, на настоящий момент у нас нет никакого подтверждающего теста на SARS к COVID. Нет иммуноферментных стандартизированных тестов, нет референсного стандарта. Первый тест должен быть с хорошей чувствительностью, а потом, по реакции на этот тест вы проводите другой тест. Это важно. Это проводилось десятилетиями в серологических тестах. Далее вы получаете данные о специфичности. Это важно и актуально, потому что мы уже говорили о чувствительности и отрицательном прогностическом значении, а теперь у нас возникает проблема о специфичности и положительном прогностическом значении. Возьмем 100 тыс. человек населения, у которых мы рассчитываем 3% заболеваемости. Если мы проводим экспресс-тестирование, о котором я говорил, то со специфичностью тест-системы 95% у нас получится два ложноположительных на каждого истинно положительного. Здесь мы говорим о том, что специфичность может быть принята на клинических основаниях, но с эпидемиологической точки зрения это полная катастрофа. Теперь другой тест, специфичность тест-системы — 99%. Гораздо лучше. Но при этом у нас один из четырех «кейсов» ложноположителен. Давайте возьмем тест-систему в 99,5% специфичности. Здесь у нас будет результат лучше, но при этом все равно один ложноположительный пациент будет на 6 пациентов в целом. С эпидемиологической точки зрения, здесь много не меняется. Это не даст вам переоценить заболеваемость. С личной точки зрения, если вы хотите конкретно дать ответ кому-то, по его личной проблеме, это трудно. Поэтому все руководства в последнее время указывают, что концепция специфичности и прогностическое положительное значение в совмещении очень важны. Это говорят и в США, и в Испании, и даже в Италии стали внедрять систему двойного тестирования.

Если вы действительно дойдете до этой специфичности, как пишут нам американские авторы в своих статьях, если вы проведете небольшое серологическое исследование по распространенности, по заболеваемости, как вы видели там, то вы получите хорошее положительное прогностическое значение. Смотрите: заболевание популяции — около 2%, специфичность — около 100%, положительное прогностическое значение — порядка 95%. Что же делать? Проводить исследования.

Что касается специфичности: мне бы хотелось сказать, что многих беспокоит потенциальная интерференция, когда вы тестируете конкретно на COVID, вы можете упустить другие штаммы коронавируса. У нас есть 6 доказательных случаев из 6 статей, и на настоящий момент перекрестной реакции не возникало. Это означает, что, как минимум для этих тестов отбор реагента достаточно важен, чтобы гарантировать, что такой интерференции не случится.

Еще одно беспокойство: это огромная запутанность в сознании о том, что касается реакции антител. Вы слышали о тестах, что они нейтрализуют антитела и не только. Мне жаль, но это не так. Все тесты, которые есть на рынке, обнаруживают связывающиеся антитела. И это важно, потому что именно они, антитела, появляются первыми, и это рекомендуется по данной инфекции. Если вы хотите увидеть нейтрализующую активность, оценить присутствие нейтрализующих антител, вам нужны вот такие методы: вы можете использовать вирусную нейтрализацию — классика, микронейтрализация — чуть более популярна и чуть менее трудозатратна, и они все требуют очень высокого уровня безопасности. Дальше вы проверяете заход вируса в таргетные клетки и тут вам надо оценить биобезопасность. Но это нельзя путать. Дело вот в чем: даже если вы тестируете путем связывающих тел, вы можете подумать, что присутствует какой-то нейтрализующий ответ. Простой пример: тут используются три традиционных теста, и если раньше результаты нам были известны, то теперь мы смотрим, что они далеко не фантастичные. Что было сделано? Были изучены пациенты иммунокомпрометированные и были изучены темп и уровень. Даже не уровень, антитела ведь не совсем тот параметр, который так можно трактовать. Так вот, если вы видите коэффициент реакции нейтрализации и ответ IgG, то вы увидите, что окно сероконверсии для обоих типов антител одинаково. И медианное время тоже одинаково. Таким образом, наш первый тезис в том, что нейтрализующая активность начинается очень на раннем этапе инфицирования. Безусловно, это разумно, это дает возможность человеку освободиться от инфекции. Чем больше движется процесс, тем более вероятно, что инфекция разрешится. Второе: здесь есть некоторый разрыв. Если вы обнаруживаете связывающие антитела и возможные антитела, которые направлены на ядро и которые не нейтрализуют, вы, может быть, вполне увидите фрагменты нейтрализующего ответа. Это показано на нашем графике «SARS-CoV-2 IgG реактивность и нейтрализующая активность». Видите, что нейтрализующий ответ начинается очень рано, вы доходите до довольно приличного уровня нейтрализации антител где-то через 2–3 недели, и это соотносится с вероятностью разрешения инфекции. И вы видите, как увеличиваются не нейтрализующие IgM и IgG. Тогда в этом месте можно подумать, что любой иммунный ответ указывает нам на повышение нейтрализующей активность, что так и есть. Но есть и плохие новости. Тогда коэффициент нейтрализующих клонов, которые активируются во время этой инфекции, очень низкий. Я проводил независимые исследования и видел их. Во всех случаях скорость нейтрализации ответа антител — где-то 2–3%, всего ответа антител, который был обнаружен за время инфицирования. Таким образом, нам нужны тесты, которые смогут реагировать конкретно на эти антитела для лучшей защиты и для того, чтобы обязательно разработать вакцину. Что у нас сейчас есть? Есть тестирование ПЦР и РНК разными методами, вы можете тестировать на IgM и IgG. Везде будут свои преимущества и свои ограничения. Сочетание результатов, может быть, даст возможность более точно разобраться с инфекцией.

Я хочу рассказать об основных чертах касательно того, что может произойти: если вы тестируете по-разному на IgM и IgG, у вас могут возникнуть образцы с позитивным IgM, где РНК еще не обнаруживается, как и IgG. Это либо продолжающаяся инфекция, когда РНК еще не определима и IgG еще пока не определима. А с другой стороны — это может быть ложно-негативный IgM, который нельзя недооценивать. Потому что тестирование на IgM технически значительно труднее, чем тестирование на IgG. Есть другой аспект, который станет более распространенным по мере того, как мы перейдем к тестированию людей в эпидемиологических целях. Это то, что у людей будет положительным только IgG, и это означает, что у этого человека была инфекция. Мы не можем сказать, когда, можем сказать, что это не новая инфекция, потому что IgM здесь нет. И как минимум мы можем считать, что инфекция находится у хозяина уже несколько недель или месяцев.

В общих чертах: что можно протестировать тестом на антитела? Что пациент был инфицирован вирусом. И вы понимаете, в случае тестирования на IgM и IgG, насколько давно было инфицирование. При этом исследование не скажет вам, разрешена ли инфекция у пациента. Серологический тест не сможет определить, выздоровел ли пациент и нет ли у него хронической инфекции. Фактический титр антител вам никогда не будет известен. В лучшем случае, это будет какое-то полуколичественное определение. Есть какие-то тесты, где используются условно стандартные единицы, но все равно, каждый тест экспрессирует разную концентрацию единиц. И это то, с чем мы сейчас боремся. И, наконец, в связывающем тесте мы никогда не узнаем, являются ли антитела нейтрализующими. Я думаю, что я постарался эти опции совместить в одном слайде. Предположим, вы тестируете обоими тестами, и серология, и ПЦР. Посмотрите на эту диаграмму: вот что, предполагается, будет происходить у пациентов с заболеванием и с высоким уровнем риска. Дотестовая вероятность положительного результата будет очень высокая. Если мы используем ту же самую схему и те же самые возможные результаты, но меняем выбранную популяцию, потому что мы движемся к популяции, где очень малый коэффициент распространенности и нет симптомов, то тут вопрос не в том, насколько хорош ваш инструмент или комбинация ваших систем и инструментов, это вопрос результатов. И специфики населения. Дело в том, что все вы знаете, что происходит, но вам приходится работать с законодателями, с людьми, которые имеют гораздо меньше опыта и понимания, и здесь, я думаю, вам нужно очень четко прояснять: неважно, насколько хорош ваш набор, инструмент, система. Это всегда комбинация данных анализа и клинических данных. Это непросто передать тем, кто принимает решения, но это обязанность тех, кто работает в здравоохранении. Есть примеры случаев, когда вы будете проводить только серологический анализ, потому что вас не будет интересовать содержание, а вам захочется посмотреть, был ли вирус этой популяции или нет. И здесь очень много противоречий. В Италии начался популяционный скрининг на основе отбора и скрининговых результатов по всей стране. Было огромное сопротивление, потому что когда у вас положительный результат, людям рекомендуется находиться на карантине и проходить тестирование на РНК. Но людям не очень нравится этот подход, потому что спустя 2,5 месяца карантина у нас начнется новый карантин. Тогда нужно ли это? Если цель скрининга только в том, чтобы сказать: заболеваемость есть, то он не нужен. Если цель скрининга — определить скрытые случаи инфицирования у населения, тогда это необходимо. То же самое относится и к отрицательным результатам. Отрицательный результат вам сообщает распространенную интерпретацию. Но какой есть период окна, когда вы тестируете только на антитела, т. е. вы можете опять рассмотреть возможность тестирования через несколько недель, а можете и проигнорировать вероятность возникновения инфекции. Если у вас в первом случае пришел положительный тест, то, может быть, к этому придется вернуться.

Итак: каждый старается разработать здесь свою собственную политику. И мы по-прежнему очень далеки от того, чтобы была хорошая политика, которая работала бы везде. И здесь, я надеюсь, не очень употребил вашим временем, но это первое, что приходит в голову всем. Отрицательный результат может говорить о недавней инфекции, это может быть инфекция, связанная с врожденным иммунитетом, есть люди, которые вообще не дают ответа антител, потому что они вырабатывают достаточно иммунитета для того, чтобы избежать инфицирования. Так же могут выработаться антитела, но на уровне ниже предела обнаружения применяемой тест-системой, и отрицательный тест на 100% не скажет вам, восприимчив ли человек к вирусу. Это то, что происходит в вирусологии. Мы не впервые с этим сталкиваемся.

Итак, применение тестов на антитела может помочь в диагностике этих заболеваний. Есть вероятные случаи, есть случаи, когда анализ на РНК отрицательный. Есть случаи, когда нельзя провести анализ на РНК. И важно подчеркнуть, что у пациентов, у которых прошло от 9 до 14 дней с момента проявления симптомов, тест будет эффективен. И для оценки количества зараженности, т. е. заболеваемости и распространенности, тесты должны использоваться. Т. е. тесты проводятся не для определения заболеваемости, они дают понимание распространенности. Если взять одну и ту же популяционную группу и протестировать ее с промежутком в 6 месяцев, тех, кто в первый раз показал негативный результат, то вы увидите, какой прирост случился за это время. Центр переливания крови Италии сейчас тестирует доноров, потому что они по определению должны возвращаться каждые 6 месяцев. Здесь можно посмотреть, как медленно инфекция распространяется по всей стране. Таким образом, тестирование на конкретный IgG может требовать определенных специфичных политик, чтобы подготовить население заранее. Большое спасибо. У меня все.

Д. Горшков: Большое спасибо. Скажите, пожалуйста, в Италии сейчас живут коронавирусом или уже футболом? Видимо, есть помехи. В конце вебинара мы вернемся с вопросами к г-ну Галли. Сейчас спикером будет выступать Татьяна Ивановна Смолянова, руководитель проекта АО «Нацимбио», АО НПО «Микроген», она находится в Москве.

Т. Смолянова: Здравствуйте, мне всех прекрасно слышно. Хочу сказать, что продолжу небольшую тему, которую поднял Клаудио — исследование и сравнение результатов, полученных в ИФА тест-системах, с результатами в реакции вируснейтрализации. Здесь — моя любимая картинка SARS-CoV-2, только чтобы показать прекрасную визуализацию. Цель работы, которую мы проводили в своей компании, чисто прикладная. Ее причина в следующем: помимо лабораторной диагностики коронавирусной инфекции есть еще определенные инициативы у производителей, связанные не только с разработкой тест-систем, но и с разработкой возможных препаратов для лечения. Мы как крупнейший российский производитель иммуноглобулинов начали работу по разработке специфического антиковидного иммуноглобулина, и первая задача, которая стоит — качественный отбор сырья. Для того чтобы его производить. Для производства иммуноглобулина сырьем является плазма. Соответственно, здесь нам нужна не просто плазма, содержащая антитела, а нужно показать, что она — вируснейтрализующая. Для этого сейчас используется сложный метод вируснейтрализации. Он долгий, крайне затратный в плане ресурсов и денежных средств. Поэтому определить тест-систему, которая с определенной долей вероятности будет определять вируснейтрализующие антитела, задача работы, которая стояла перед нами. Есть принципиальное отличие между нашей задачей и определением диагностической чувствительности, специфичности. Но в ходе исследования мы собрали достаточно большой массив данных, чтобы ответить и на вопросы в плане диагностической специфичности и чувствительности. Я постараюсь рассказать, что мы получили.

Если мой результат ИФА, который я получаю, положительный или отрицательный, с какой долей вероятности я могу ему доверять, врач может доверять результату анализа пациента, если он положительный? Не может ли он быть ложноположительным? С какой долей вероятности он может быть ложноотрицательным, если он отрицательный? Как вы знаете, несколько российских производителей зарегистрировали систему со 100% чувствительностью и 100% специфичностью. Это хорошо, но маловероятно. Каким образом мы действовали? Помимо коронавируса SARS-CoV-2 есть другие коронавирусы, поражающие человека. Если посмотреть на филогенетическое древо, есть определенные паттерны белков, которые похожи. Соответственно, антитела, выработанные у человека год-два назад могут быть специфичны к SARS-CoV-2, это может влиять в том числе и на результат ИФА. Поэтому для того, чтобы четко определить SARS-CoV-2, нужно взять вариабельную часть, которая специфична только для SARS-CoV-2, менее специфична или не встречается в других коронавирусах, и такой частью является, согласно литературным данным, RBD-домен спайк-белка. Если посмотреть на этот слайд, от целого вириона к RBD-домену мы имеем повышение вариабельности и, соответственно, повышение специфичности ИФА тест-систем, если такой антиген будет использоваться в ИФА тест-системе. Следуя такой логике, мы купили n-ное количество тест-систем различных производителей, в которых использованы различные белки в качестве антигена засорбированного на планшете. Относительно того, какой антиген используется в ИФА-тест-системе, такие по специфичности антитела будут определяться в исследуемом образце. Если мы берем ИФА тест-тему, в которой тела, специфичные к RBD, если S-белок — это антитела, специфичные к RBD, потому что он входит в состав S-белка, и остальные антитела к S-белку. Если это система, в которой несколько белков, соответственно, большее количество типов антител по специфичности, будет детектироваться в данном образце.

Мы взяли 6 производителей, которые отличаются именно антителами. Хочу оговориться: покупали мы данные тест-системы, начиная с начала апреля. Что было на рынке, то и покупали. Сейчас разнообразие больше, конечно. В качестве ИФА тест-системы для RBD-домена мы взяли производства НМИЦ Гематологии, что сейчас производится на производственной площадке XEMA, Euroimmun — они содержат белок S1; «Вектор-Бест» по данным производителя — S-белок; «Литех» по данным производителя S2 домен S-белка. Китайский производитель Taizhou — S+N-белок. И американский производитель Creative Diagnostics поступил хитро, они сначала анонсировали, что это полный вирион, но, в отличие от тест-системы «Вектор-Бест», это не вирусный лизат, это смесь рекомбинантных белков. Что драматически отличает ее в пользу лучшей специфичности. Из этой компании сразу выбыл Taizhou, потому что данная тест-система потрясающего качества кроме своего положительного контроля не дала сигнал ни в одном из образцов.

Теперь что такое вирус-нейтрализация: если вирус добавляют в культуру клеток, в нашем случае это культура клеток Vero, то вирус заражает клетки, и они умирают. Под микроскопом видно цитопатический эффект, клетки умирают зонами. Если добавить какой-то агент, в нашем случае это будут вирус-нейтрализующие антитела, то тогда цитопатического эффекта можно избежать. Если мы берем образец, в котором могут содержаться вирус-нейтрализующие антитела и его последовательно разводим, вносим в лунки с культурой клеток Vero последовательно разведенный образец, возможно, содержащий вирус-нейтрализующие антитела и вирус, мы видим раститровку. Белым будут обозначены живые, таким образом, мы можем определить вирус-нейтрализующий титр. Соответственно, там, где есть синяя окраска, там клетки остались живы, где белая окраска — клетки умерли, это для визуализации. Таким образом определяется титр вирус-нейтрализации в конкретном образце. Раститровку делают шагом 1:2 и таким же образом сейчас исследуют плазму, которую потом используют для прямого переливания при лечении коронавирусной инфекции. Данный метод требует ведения культуры клеток, стерильных условий; в РФ работают с живым вирусом, не используют конструкты. И так же данный метод занимает от 5 до 7 дней. Он сложный, дорогой, долгий, если есть возможность заменить его ИФА, было бы замечательно.

Мы взяли контрольные выборки, разные. Это пробы, которые подразумеваются отрицательными. 50 образцов здоровых людей, у которых не было ОРВИ-симптомов за последние 6 месяцев, группу с ОРВИ, но не коронавирусом — 150 человек. Что мы увидели? В группе здоровых ни одна из тест-систем, кроме Creative Diagnostics не дала положительных образцов, они были по вируснейтрализации отрицательны, я предполагаю, что это неспецифический перекрест с какими-то другими коронавирусными инфекциями. Что касается группы ОРВИ, здесь можно посмотреть: если говорить по цифрам, то получается, что все тест-системы определили минимум два образца, а «Вектор-Бест», «Литех» и Creative Diagnostics больше. Но это разные образцы. Таким образом выглядит выборка результатов по группе ОРВИ: два образца были положительными в реакции вируснейтрализации, и можно предположить, что эти люди переболели бессимптомно.

Самый интересный результат — препараты иммуноглобулинов. Это продукты, произведенные из плазмы, производственный пул составляет не менее 1 000 образцов плазмы доноров, и плазма была собрана, самое позднее, в 2018 году. Или ранее. Так как она должна быть карантинизирована, характеризована и т. д., это достаточно длинный производственный процесс. Мы можем предположить, что ни один из препаратов иммуноглобулинов из 72 серий не должен давать положительного результата. Какие результаты видим мы? В тест-системе ГНЦ 6 серий дали положительный результат, в Creative Diagnostics — одна. «Вектор-Бест» и «Литех» — 25 и 42 серии соответственно, что 35% и практически 60%. Скорее всего, тут вопрос не в специфике антигена, который используется, а в реагентах, потому что это использование вне инструкции. Препарат иммуноглобулинов — это концентрированный препарат, мы брали 1 микролитр, это больше иммуноглобулинов, чем содержится в 1 микролитре плазмы человека. Соответственно, скорее всего реагенты данных тест-систем дали такой неспецифический сигнал в образцах.

Так же мы протестировали 1 000 образцов здоровых доноров. Здесь результаты предварительные, мы еще ожидаем результаты по вируснейтрализации, однако можно сказать, что из 1 040 образцов 12 образцов были положительны во всех тест-системах. Мы ожидаем титры вируснейтрализации по данным образцам, чтобы сделать выводы. И также n-ное количество образцов, которые дали положительные сигналы в одной из тест-систем и не сработали в других тест-системах. Ложноположительный это сигнал или ложноотрицательный — мы узнаем вскоре. На данный момент комментировать не могу. Если говорить про 12 положительных проб из 1 040, что это значит? Это значит, что процент доноров, которые переболели бессимптомно, то есть, это процент популяции, который переболел бессимптомно, менее 2%. 1,2–1,7%, в зависимости от того, отрицательные пробы по «Вектор-Бест» или Creative Diagnostics. Это ложная низкая чувствительность или это высокая специфичность.

Так же мы протестировали 227 образцов больных. Это люди с установленным диагнозом, подтвержденным ПЦР. Каждый образец был взят не ранее, чем на 28 день от начала заболевания. То есть, можно ожидать, что сероконверсия уже произошла, выработка IgG антител уже происходит, и мы должны наблюдать хороший уровень сигнала. Из 227 образцов 157 были положительными во всех тест-системах и в реакции вируснейтрализации, а вот 70 образцов стоит обсудить. Например, в четырех образцах не было сигнала ни в одной тест-системе, ни в реакции вируснейтрализации. Это ложноположительный диагноз ПЦР или это Т-клеточный ответ? Мы не узнаем, потому что для этого нужно посмотреть конкретного человека, посмотреть его Т-клеточный ответ. Возможно, мы с коллегами из НМИЦ Гематологии попробуем провести эту работу, но на данный момент ответа у меня нет. Так же четыре образца не дали положительного сигнала ни в одной тест-системе, но показали слабый титр в реакции вируснейтрализации. Тут вопрос: это ложноположительный результат реакции вируснейтрализации и также Т-клеточный ответ? Мы не знаем. Это всего лишь 1,7% из выборки, результат вполне приемлемый. Остальные: ЛО — ложноотрицательный, ЛП — ложноположительный результат. Нет титра вируснейтрализации, есть сигнал. То есть, это ложноположительный для меня, как человека, у которого есть задача найти соответствие между титром вируснейтрализации и наличием антител в данной ИФА тест-системе. С точки зрения диагностической чувствительности и специфичности, это положительный сигнал, просто антитела, которые выработались, не нейтрализуют вирус. То, что интересно с диагностической точки зрения, выделено красным. Соответственно рассчитана чувствительность в соответствии с количеством ложноотрицательных результатов. Таким образом, мы видим, что здесь показали хороший результат тест-система НМИЦ Гематологии, Creative Diagnostics и Euroimmun дали около 90%. «Вектор-Бест» за счет низкой специфичности показывает достаточно высокую чувствительность.

Какие выводы можно сделать сейчас? Я не показывала ROC-анализ по прямой корреляции между вируснейтрализацией и данными тест-системами. Выявить можно, но она неудовлетворительная для наших производственных нужд. Прямая корреляция достаточно слабая. Мы используем ROC-анализ для того, чтобы определить тот уровень сигнала, после которого с вероятностью 85% у нас определяются удовлетворяющий нас титр антител, вируснейтрализующих. Но данные результаты я сейчас представить не могу, хочу сказать, что предварительно лучшие результаты показывает НМИЦ Гематологии и Euroimmun. Мы с нашей потребностью, с нашей задачей готовы терять n-ное количество образцов, главное, чтобы был определенный процент правильных, не менее 85 с титром вируснейтрализации. Почему мы готовы на эти ошибки? Потому что мы работаем с пулом, мы не работаем с индивидуальной плазмой. Прямая корреляция нужна, если бы мы хотели вместо вируснейтрализации применить ИФА тест-систему для выбора плазмы для переливания. На данный момент по нашим результатам это невозможно.

Какие промежуточные выводы я сейчас могу сделать?

Не все наборы, не все тест-системы, особенно российские, выдержали проверку при работе с минипулами, при работе с препаратами иммуноглобулинов. Результаты по минипулам созвучны результатам с иммуноглобулинами. «Вектор-Бест» и «Литех», к сожалению, не предназначены для работы, с индивидуальными работают нормально. Для диагностических целей важнее валидация тест-системы, чем выбранный антиген. В образцах доноров менее 2% положительных проб, это говорит о проценте скрыто переболевших в популяции. Соответственно, можно сделать выводы: половина людей не переболела точно. И позже мы можем сделать выводы по динамике антител, когда будут данные. И ROC-анализ. На данный момент выводов сделать нельзя.

Данная работа была проведена совместно с НМИЦ Гематологии и компанией «ДНКОМ», они проводили нам тестирование вслепую, ни один не знал титра вируснейтрализации, мы это собирали уже позже, после получения результатов в ИФА тест-системах. Большое всем спасибо!

Д. Горшков: Из чата есть вопрос именно к Вам.

Т. Смолянова: От Евгения Борисовича, спасибо за вопрос! На данный момент есть рекомендации. Как Вы знаете, Департамент здравоохранения Москвы проводит клиническую работу по применению плазмы реконвалесцентов — это раз. Два: есть рекомендации США, я так понимаю, что Департамент здравоохранения Нью-Йорка, по-моему, выпустил. Что касается международных стандартов — к сожалению, мы сейчас живем в такой ситуации, когда у нас в принципе нет никаких международных стандартов. Например, стандартная панель для антител была бы очень кстати для качественной валидации тест-систем. Мы очень ждем хорошо отвалидированных тест-систем. Могу признать, что в данной работе очень не хватает результатов по тест-системе Abbott, мы не смогли включить ее в связи с ограниченностью бюджета, а было бы очень интересно посмотреть, какие результаты по данной выборке она покажет. Международных стандартов нет, есть рекомендации по титру. Об этом я могу позже написать.

Д. Горшков: Татьяна, большое спасибо! Мы перелетаем в Санкт-Петербург, на связи Анастасия Самсонова, Центр геномной биоинформатики имени Добржанского, Санкт-Петербургский Госуниверситет. «Генетические детерминанты, ассоциированные с восприимчивостью и протеканием инфекции COVID-19».

А. Самсонова: Добрый день. Мы биоинформатики, в силу профессиональной деформации в данном контексте нас интересуют, скорее, вычислительные методы, интеграция информации, полученной с помощью высокопроизводительных методов омики и интерпретация этого всего массива информации для целей прогностики и стратификации пациентов, нахождения новых мишеней и т. д. Из всего спектра проблем, возникших в связи с эпидемией, для нас наибольший интерес представляют механизмы, детерминанты взаимодействия патоген-хозяин. Критически оценивая гипотезы, которые сейчас циркулируют в научной и около научной среде, мы разделяем идею о том, что разнообразие клинических проявлений, которые мы наблюдаем на макроуровне, которые показаны на слайде «Клинические проявления инфекции», а также тяжесть протекания болезни, определяются, скорее, генетическим статусом хозяина, нежели генетической вариабельностью самого вируса. Механизмы взаимодействия патоген-хозяин проявляются, прежде всего, на клеточно-молекулярном уровне, что я попыталась здесь изобразить. И для описания их с целью понимания биологической сущности процессов, таких как иммунный ответ, заражение, резистентность, в нашем распоряжении имеется широкий диапазон омиксных технологий: геномика, транскриптомика отдельных клеток или отдельных ядер и протеомика. Современные методы вычислительной биологии позволяют нам эффективно обрабатывать, интегрировать, интерпретировать большие объемы омиксных данных, а так же быстро решать прикладные задачи: поиск биомаркеров, поисков лекарственных решений, а так же построение прогностических моделей.

Я немного расскажу о применении каждой из этих технологий получения информации о заболевании и о биологии протекании этого заболевания на примере каждой из этих технологий. Начну с самого модернового подхода и самого интересного с точки зрения биоинформатики и, может быть, клеточной биологии. В качестве иллюстрации последних достижений в области молекулярных механизмов иммунного ответа на инфекцию я хочу рассказать о применении технологии исследования транскриптомов отдельных клеток и совмещения информации, полученной с помощью этой технологии, а также анализа изображений.

Известно, что тяжесть протекания заболевания ассоциирована с изменениями в ответе периферической иммунной системы, потому что у пациентов очень часто фиксируется лимфопения, истощение этих клеток и изменение в популяции иммунных клеток. Задача, которую решали стэнфордские ученые, состояла в построении клеточного атласа заболевания, чтобы понять биологическую природу изменения в популяции иммунных клеток. А также характеризовать возможные вовлеченные биологические механизмы. И при этом совершенно не обязательно иметь когорты безумного размера, потому что данное исследование, которое я здесь представляю, носит, безусловно, предварительный характер, но было достаточно образцов крови 7 пациентов и 6 здоровых волонтеров. В результате анализа транскриптома им удалось не только охарактеризовать популяции клеток и изменение в этих популяциях в ответ на инфекцию, но и описать новый тип иммунных клеток, а так же охарактеризовать дифференциальный ответ разных популяций иммунных клеток у здоровых людей, что показано здесь синим у людей с легкой формой заболевания и у больных, которые нуждаются в аппаратах искусственной вентиляции легких. Имея данные дифференциальной экспрессии, удалось выявить сигнальные пути и охарактеризовать регуляторные генные сети, которые активируются в ответ на COVID. Исследование аналогичного характера сейчас ведется в Гарварде, где исследуются критические случаи, когда организм и иммунная система пациента не справились, человек умер. Дизайн и логистика этого исследования там гораздо сложнее, безусловно, поскольку иногда с момента смерти пациента до того момента, когда образец попадает к биологам-клиницистам проходит меньше часа. Они совершенно оптимизировали процессинг образцов. Но когда популяция иммунных клеток уже более-менее охарактеризована с помощью технологий либо single cell sequencing, либо single nuclear sequencing, то для более полного понимания механизма взаимодействия вируса и хозяина, можно использовать разнообразные методы визуализации информации или регистрации по локализации вирусных частиц и интересующих нас белков иммунной системы конкретно в тканях. И таким образом, в дополнение к информации о регуляторных процессах и цитометрии мы получаем данные о взаимодействии между разными типами клеток и то, какие клетки преимущественно поражаются при заболевании.

Для чего нужны подобные типы исследования? Они в перспективе могут ответить на вопросы: почему, например, у некоторых пациентов возникают тяжелые заболевания в легких или в других органах, которые в легких, например, сопровождаются цитокиновым штормом или сильным воспалением, а у некоторых — нет. И почему у вируса такой широкий репертуар поражения органов, а также почему у разных пациентов затронуты разные органы?

Транскриптомика — это очень здорово, и она может пролить свет на механизм взаимодействия вируса и хозяина, что релевантно для фармакологии, но объяснить, почему у одного человека заболевание протекает бессимптомно, а другой попал в больницу с тяжелым воспалением легких, она, скорее всего, не сможет. Ответ на этот вопрос нам может дать, скорее всего, только секвенирование геномов пациентов. Самый простой способ ответить на этот вопрос, связанный с сопротивляемостью организма, это провести полногеномный ассоциативный анализ на когортах пациентов. Здесь я показываю китайскую статью, которая очень быстро появилась, через 2–3 месяца после того, как пандемия была объявлена. Исследование стандартное, результат можно получить достаточно быстро, но оно очень затратное. Китайцы секвенировали 300 пациентов с лабораторно подтвержденным COVID и разной тяжестью протекания заболевания. В качестве контроля брались данные проекта «1000 геномов», китайская популяция и китайская референсная панель, данные которой еще пока не опубликованы. Это исследование сопровождалось не только фенотипическим описанием протекания болезни — бессимптомное, слабое, умеренное, тяжелое, критическое, но еще были проведены 46 лабораторных тестов, которые, фактически, полностью описали состояние организма. На выходе они получили новый биомаркер, специфический, скорее всего, для китайской популяции. Это трансмембранный белок ТМЕМ189, который участвует в интерлейкиновом пути, и они ясно показали его связь с тяжестью протекания болезни. Оказалось также, что этот полиморфизм ассоциирован с изменением уровня экспрессии в некоторых тканях, включая легочную. И что прогноз у пациентов с повышенным уровнем экспрессии этого гена гораздо хуже. Данные проекта «1000 геномов» позволяют посмотреть на распространенность этого маркера по планете. И данные показывают, что в Африке этот маркер распространен больше, чем в других местах, что согласуется с предварительными наблюдениями о том, что у людей с африканскими корнями болезнь протекает более тяжело.

На самом деле, эта китайская когорта — это одно из первых исследований на эту тему — специфична для китайской же популяции, либо мощности анализа, который они провели, было недостаточно. Последние результаты анализов, проведенных на когортах из разных стран, но объединенных общими фенотипическими признаками, показывают статистическую значимость тяжести протекания заболевания с группой вариантов на третьей хромосоме. Больше пока на эту тему мало что известно, эти данные были показаны широкой общественности буквально вчера-позавчера.

Проявление многих инфекционных болезней тесно связано с генетическими вариантами главного комплекса гистосовместимости, и эти варианты играют важную роль в представлении антигенных детерминант и активации иммунного ответа. На тех же данных китайской когорты, на данных полногеномного секвенирования, китайские исследователи помимо ассоциативного анализа провели аналогичный по своей сути анализ ассоциаций специфических аллелей человеческого лейкоцитарного антигена с тяжестью же протекания болезни. И нашли маркеры, связанные с тяжестью протекания заболевания, которые на этом слайде показаны стрелочками. Собственно, HLA-аллели. В отсутствие экспериментальных данных, как показывает опыт американских ученых, похожий анализ можно уверенно провести in silico. Командой из Аризоны был разработан алгоритм, позволяющий эффективность презентации вирусных антигенов иммунной системы. И показатель для количественной оценки эффективности представления вирусных антигенов. Этот показатель определяется числом пептидов, связывающих систему, или иным HLА-аллелем и частотой этого аллеля в той или иной популяции. Особый интерес представляют отдельные пептиды вирусной оболочки, преимущественно структурные, которые в силу своей консервативности и высокой экспрессии являются предпочтительными кандидатами для разработки вакцин. Они дальше использовали этот показатель, чтобы построить регрессионную модель, которая показывает удельную смертность в популяции в зависимости от разработанного показателя и, видимо, их показатель имеет смысл, потому что, например, в Италии и в Великобритании, где смертность — одна из самых высоких в Европе, значения этого показателя ниже, чем в Южной Корее, которая, как показывает статистика, достаточно эффективно справилась с всплеском заболевания.

Адаптируя этот метод к имеющимся в России данным гематологических центров о частотах HLA-аллелей в популяциях, можно попробовать предсказать удельный показатель смертностей в регионах России, как показано на слайде «Популяционные различия в HLA-генотипах»: частоты HLA-аллелей отличаются между, например, Санкт-Петербургом и другими регионами. Эти аллели выделены в красные квадратики. Исходя из этой информации, скорее всего, действительно, смертность в разных регионах чисто по генетическим факторам будет немного разная.

И в заключение я хочу рассказать о перспективном методе омиксной диагностики, который уже показал свою эффективность. Это клиническая протеомика, которая предлагает относительно дешевый и высокопроизводительный метод диагностики и, как следствие, получение сигнатур для стратификации пациентов. Исследование выполнено командой из Берлинского госпиталя Шарите, статья доступна на medRxiv. В этом исследовании они разработали новую масс-спектрометрическую платформу для работы с образцами пациентов. Главное их достижение заключается в автоматизации, потому что все тесты делаются на планшетах, что позволяет достичь высокой производительности, и так же они оптимизировали стадию жидкой хроматографии, чтобы весь процесс проходил быстро и дешево. Их поисковая когорта состояла из 31 пациента, попавшего в госпиталь. Здоровый референс — это публичные данные популяционного исследования Generation Scotland, опубликованных в 2013 году, где доступны образцы крови и геномы современных нам жителей Шотландии. Классификация пациентов проводилась согласно классификации ВОЗ. Рассматривалась разная тяжесть протекания заболевания, контрольная группа состояла из 17 пациентов — валидационная когорта, и 15 здоровых. Им удалось найти 27 новых биомаркеров в плазме крови, которые связаны с тяжестью протекания инфекции. Очевидно уже, что некоторые из этих белков могут быть использованы как потенциальные мишени для разработки лекарств. Этот результат подтверждает способность клинической протеомики быть не только инструментом для абстрактных биологических исследований, но и быть быстрым и надежным инструментом для клинической диагностики.

В заключение хочу сказать, что весь компендиум этих исследований, которые произошли буквально за последние 3–4 месяца, убедительно демонстрирует торжество концепции from Bench to Bedside, в которую вкладывались миллиарды за последние 10 лет во всем мире. С момента объявления пандемии прошло меньше полугода. Первые предварительные данные о биомаркерах, потенциальных лекарственных препаратах, которые могут быть использованы для лечения, для тех препаратов, которые могут быть переориентированы для облегчения симптомов COVID, механизмов иммунного ответа, предрасположенности, факторов предрасположенности уже известны. Это стало возможным не только благодаря серьезным финансовым вливаниям, но и разумной организации клинических и фундаментальных исследований. Тут важную роль играет открытость и доступность клинических данных, развитие биоинформатических ресурсов и биобанков во всем мире, а так же развитие национальных геномных проектов.

Что касается России, которая с точки зрения популяционной генетики весьма гетерогенна: для разработки эффективных вакцин, надежных диагностических тестов, оценок рисков и прогностики необходимо проведение детальных клинических исследований, учитывающих генетическую структуру населения. Нам абсолютно необходимы когорты пациентов и люди, которые переболели бессимптомно. Нужна правдивая статистика и точные клинические данные. И, конечно, для будущих фармакологических разработок, совершенно необходимы омиксные исследования, проведенные на post mortem образцах. Пожалуй, это все, что мне есть сказать. Большое спасибо.

Д. Горшков: Большое спасибо за доклад. Один из самых главных вопросов, который интересует всех: когда появится вакцина и насколько она будет действенна? Почему нельзя дать точный ответ? Потому, что до сих пор идут испытания или долго проходит процесс апробации?

А. Самсонова: Ну, самые оптимистичные прогнозы, которые циркулируют везде — полтора-два года с момента объявления пандемии. Я думаю, что это достаточно оптимистично, хотя я не могу квалифицированно судить об этом. Что касается апробации — наверное, просто диверсификация проявлений и то, что мы очень мало знаем про иммунный ответ на этот вирус, осложняет разработку вакцин.

Д. Горшков: Какова вероятность того, что сам по себе вирус станет слабым, что количество больных в мире станет ничтожно малым, и вакцина не потребуется?

А. Самсонова: Я не думаю, что кто-то сейчас может ответить на этот вопрос. Из-за того, что мало информации, очень много рассуждений идет про стадный иммунитет, что база, на которой живет вирус, исчезнет, сам вирус потеряет свою агрессивность. Честно говоря, мне кажется, что, скорее всего, более вероятна выработка со временем стадного иммунитета. Очень много людей, которые переболели бессимптомно и не знают об этом.

Д. Горшков: У нас в чате достаточно большое количество вопросов, связанных с частными случаями и не связанных с ПЦР-диагностикой и тестированием. Много вопросов, связанных с лечением. Хочу попросить Германа Александровича подвести итог сегодняшнего вебинара. Может быть, он поставит жирную точку сегодняшнему марафону.

Г. Шипулин: Я бы хотел поблагодарить всех, кто участвовал в семинаре. Мне понравились все доклады, у Анастасии в докладе много неизведанного. Генетики взаимодействия макро- и микроорганизмов пока не понимают. Все работы, которые сейчас делаются, они пока поисковые. Я видел несколько работ по разнообразию TC-рецепторов, участков, которые управляют экспрессией цитокинов, потому что цитокиновый шторм как осложнение при данной инфекции тоже имеет место. Такая детальная генетика, конечно, очень занимательная, потому что самая главная загадка данного заболевания для меня — недостижение пока в популяции 60–70% инфицированности. Но почему мы имеем при этом снижение заболеваемости? Одна из версий заключается в том, что, может быть, вирус инфицирует чувствительную группу населения, а потом уже сталкивается с более резистентной. Те модели, которые мы рассматривали на предыдущем семинаре, этот фактор не принимали во внимание, считается, что все одинаково чувствительны. Поэтому на этом основании строятся все математические предсказания. Но если предположить, что население неоднородно, есть более или менее чувствительные группы, если в каждой из популяции в регионе мы увидим… Анастасия рассказала, что даже HLA-аллели в разных регионах отличается, этот вопрос не изучен, тут работать и работать. Что-то мне подсказывает, что есть две причины затухания эпидемии. Первая — то, что фактически вирус инфицирует не всех, а только чувствительные группы населения. А второе — идет постепенная эволюция у вируса, он приспосабливается. Мы видели такой на примере тех эпидемий, которые я показывал. H3N2 вызвал до полутора миллиардов заболевших и 700 тыс. умерших, сейчас он циркулирует, но такое количество инфицированных и умерших мы уже не видим. То же самое относится к испанскому гриппу, H1N1 был просто катастрофой. Сейчас мы его называем сезонным гриппом, летальность уже не такая, как была в то время. Только иммунной прослойкой это не объяснишь, нужны более весомые предположения, генетические и математические. Что касается лабораторных тестов, то, конечно, мы много, чего достигли, но эпидемия не заканчивется, нам еще нужно много работать и в плане улучшения качества диагностики и в плане понимания того, как правильно использовать разработки алгоритмов диагностики. Я очень рад, что уже появились хорошие ферментные тесты, серологические тесты. Гениально было бы, если бы они были связаны с тестами на нейтрализацию. Но даже и без этого они играют огромную роль. Я думаю, что в ближайшее время нас ждут уже алгоритмы, созданные на основе двух методов диагностики: ПЦР и серологические тесты. Ну и быстрые тесты — эта эпидемия при всех своих ужасных последствиях имеет одно важно качество: она всколыхнула внимание к лабораторной диагностике инфекционных заболеваний. В России появилась 21 новая компания, появились новые тесты, которые до этого не были зарегистрированы. Я думаю, что такая эволюция приведет к тому, что в ближайшее время сам ландшафт лабораторной диагностики будет существенно изменен. Если до этой эпидемии у нас о быстрых тестах в стране практически не говорили, то сейчас у нас 5 тестов уже, и думаю, что в будущем специалисты поймут, что незачем ждать ПЦР 3 часа, когда можно сделать за 15 минут. Это, по сути, изменит менеджмент коронавирусной инфекции, и не только ее.

Д. Горшков: Нас благодарят за создание данной конференции, но я хотел попросить подвести итог Клаудио Галли, насколько ему было интересно участие в нашем вебинаре.

К. Галли: Большое спасибо, замечательная получилась конференция, мы очень много узнали. Лично я узнал много. Для меня есть абсолютная необходимость создать в каждой стране очень четкую политику относительно того, как регулировать и использовать серологические тесты. Это самое важное в диагностике инфекционных заболеваний. Существует какое-то отсутствие ответственности у многих органов власти, которые так и не занимают никакой позиции по этому поводу. А это нужно. Нужно определить пороги: где хранится приемлемость для серологических тестов и как правильно ими пользоваться. Здесь нет других отдельных слов и путей, нам надо молекулярную диагностику совмещать с серологической и определить, для каких целей использовать ее. Сейчас, а не через 6 месяцев, и не только в России, но и в Италии тоже.

Д. Горшков: Большое спасибо, надеюсь, что на Чемпионате Европы в 2021 году в финале сыграют сборные России и Италии. Большое спасибо всем участникам, это был проект, организованный порталом PCR.news, мы обязательно еще увидимся, и все самые важные вопросы, связанные с ПЦР-диагностикой, будут подниматься на нашем портале. Надеюсь, что это время было вам интересно. До свидания!

Добавить в избранное

Вам будет интересно