Белок TRIM3 подавляет опухолеобразующую активность клеток меланомы путем убиквитинирования YAP1

Меланома — злокачественная опухоль, развивающаяся из меланоцитов, — наиболее инвазивный тип рака кожи, склонный к метастазированию и с самым плохим прогнозом. Авторы исследования, опубликованного в Scientific Reports, проверили, как влияет уровень экспрессии белка TRIM3 на патогенез меланомы.

Белки семейства TRIM участвуют в различных процессах, играющих важную роль в прогрессии рака, включая модуляцию роста клеток, апоптоза и мобильности. TRIM3 известный прежде всего своей активностью E3 убиквитинлигазы, регулирует стабильность и функцию белка через убиквитин-протеасомную систему. Однако экспрессия и молекулярные функции TRIM3 при меланоме еще не были описаны.

Авторы исследования установили, что по данным GEPIA (сайт для интерактивного анализа экспрессии генов) в большинстве образцов меланомы снижен уровень экспрессии TRIM3. Снижение его экспрессии в клетках меланомы подтвердило иммуногистохимическое исследование клинических образцов. Не было показано достоверной корреляции экспрессии TRIM3 с возрастом или полом пациентов, однако наблюдалась сильная корреляция с патологической стадией заболевания. На стадиях I и II экспрессия TRIM3 была снижена в 10 из 37 образцов, а на стадиях III–IV — во всех пяти проанализированных образцах.

Влияние оверэкспрессии или нокдауна TRIM3 на фенотип клеток in vitro изучали на клеточных линиях меланомы M14 и A375. Клетки M14 были трансфицированы плазмидой с геном TRIM3, которая обеспечивала оверэкспрессию TRIM3, а клетки A-375 – плазмидами с генами малых интерферирующих РНК (si-TRIM3-1 или si-TRIM3-2), нацеленных на мРНК TRIM3 для подавления экспрессии.

Оверэкспрессия TRIM3 снижала оптическую плотность культуры клеток, в то время как нокдаун TRIM3 ее увеличивал. (Оптическая плотность является показателем пролиферации и выживания клеток.) Клоногенный анализ показал, что повышенная экспрессия TRIM3 уменьшала, а ее подавление увеличивало количество колониеобразующих клеток. Кроме того, оверэкспрессия TRIM3 уменьшала, а его нокдаун увеличивал количество клеток, способных к инвазии, а также дистанцию миграции клеток. Можно сказать, что уровень экспрессии TRIM3 отрицательно коррелировал с пролиферацией, инвазивностью и подвижностью клеток миеломы.

С помощью проточной цитометрии авторы показали, что сверхэкспрессия TRIM3 увеличивает, а нокдаун уменьшает частоту апоптоза. Анализ уровней белков апоптоза методом вестерн-блоттинга подтвердил, что TRIM3 способствует апоптозу клеток меланомы.

Известно, что белок YAP1 играет важную роль в инициации, инвазивности и резистентности опухоли к терапии и может активно экспрессироваться в клетках меланомы. Авторы показали, что сверхэкспрессия TRIM3, не влияя на количество мРНК YAP1, снижала уровень YAP1 и уровни мРНК его мишеней (генов CTGF и CYR61). Подавление экспрессии TRIM3 давало противоположный эффект.

Для анализа белок-белкового взаимодействия между TRIM3 и YAP1 клетки котрансфицировали плазмидами, экспрессирующими рекомбинантные белки HA-YAP1 и Flag-TRIM3. (Гемагглютинин НА и октапептид Flag — искусственные эпитопы, к которым имеются специфичные антитела. Прикрепление такой метки-тега к белку, к которому антитела нет, облегчает его исследование.) Коиммунопреципитация белковых комплексов с антителами к Flag и последующий вестерн-блот анализ с антителами к НА подтвердили, что белки взаимодействуют.

Авторы также показали, что TRIM3 участвует в деградации YAP1, прикрепляя к нему убиквитиновую метку и направляя в протеасому. Клетки с нокдауном TRIM3 обрабатывали циклогексимидом (ингибитор трансляции, останавливающий продукцию белков) и наблюдали уменьшение количества YAP1 со временем. Нокдаун TRIM3 замедлял деградацию YAP1.

Чтобы доказать, что TRIM3 регулирует количество YAP1 именно за счет убиквитинирования, клетки трансфицировали одновременно плазмидами Flag-TRIM3 и HA-UB (для экспрессии меченного НА убиквитина), культивировали 48 часов и обрабатывали мощным обратимым ингибитором протеасом MG132. Уровень убиквитинированного YAP1 также оценивали с помощью иммунопреципитации и вестерн-блот-анализа, и он возрастал в присутствии TRIM3.

В заключение, чтобы показать, что физиологические эффекты TRIM3 связанны именно с воздействием TRIM3 на YAP1, авторы провели эксперимент по восстановлению фенотипа (rescue assay). Они осуществили нокдаун YAP1 в клетках с нокдауном TRIM3, и это значительно ослабило «противораковые» эффекты инактивации TRIM3 — увеличение инвазивности, подвижности, ускорение роста, увеличение экспрессии CTGF и CYR61 и др.

Высокая экспрессия TRIM3 приводит к убиквитинированию и деградации YAP1 и затем к ингибированию пролиферации клеток и стимуляции апоптоза. Credit: Sci Rep (2025). DOI:  10.1038/s41598-025-11317-y |  CC BY-NC-ND 4.0

Итак, во многих образцах меланомы наблюдается пониженная экспрессия TRIM3, ее подавление усиливает рост и подвижность, а также подавляет апоптоз клеток меланомы in vitro. Данные эффекты, что для меланомы было показано впервые, в значительной мере обусловлены влиянием TRIM3 на содержание коактиватора транскрипции YAP1 путем его убиквитинирования и деградации.

Сигнальные пути Hippo и PI5PI4 совместно регулируют работу коактиватора транскрипции YAP

Путь Hippo препятствует развитию меланомы