МД-2021, день 2. Молекулярная диагностика COVID-19

Почему геномов коронавируса из России так мало в базе данных GISAID, чем отличаются российские линии штамма дельта, есть ли коронавирусы у наших летучих мышей, какой ПЦР-тест одновременно определяет коронавирус и грипп, а какой отличает истинно отрицательный результат от неправильно взятого мазка.

Credit:
123rf.com

О геномной эпидемиологии варианта дельта в России рассказал Георгий Базыкин (Сколтех, ИППИ им. А.А. Харкевича РАН, Москва). В начале доклада он поблагодарил GISAID и росссийский консорциум по секвенированию геномов коронавируса CoRGI за доступ к данным.

Глобальная картина разнообразия коронавируса с распространением В.1.617.2 (вариант дельта) стала довольно скучной: всюду, откуда есть данные, частота дельты близка к единице. Но сама дельта имеет значительные генетическое разнообразие. Сублинии В.1.617.2 обозначаются буквами AY с номерами.

В России распространение дельты началось в мае, скорость логистического роста составляла примерно на 10% — быстрее, чем, например, в Великобритании, где дельте пришлось конкурировать с альфой. Российская дельта необычная: для нее характерно сочетание мутаций, которое крайне редко встречается в других регионах. Преобладают мутации G1048T и C27527T, они могут дополняться третьей.

Почему именно эти три варианта? Можно предложить различные объяснения, например, малое число завозов в Россию (однако известно, что дельты завозили десятки раз, но только одной линии «повезло»), суперраспространение ранней весной, эффект основателя, случайный дрейф частоты и, наконец, самая неприятная версия — адаптивное преимущество, которые дают вирусу «русские» мутации.

В пользу адаптивного преимущества говорит рост частоты варианта и одновременный рост числа новых случаев. Частота этого варианта растет и в других странах мира, однако не во всех: где-то она убывает, где-то сначала растет, потом убывает. При появлении самой дельты картина роста была одинаковой везде.

Что касается суперраспространения российского варианта — действительно, его частота изначально была высокой, но она росла и в дальнейшем. Этот вариант дельты не был первым завезенным в Россию, быстрый рост наблюдался сразу в двух географических точках, затем началось быстрое распространение в регионах; к июню он был уже везде.

Неясно, насколько велик вклад эффекта основателя: страны, с которыми у нас сильный пассажиропоток, мало секвенируют, отметил Георгий Базыкин. Высокое однообразие дельты в России необычно, но подобное встречается и в других странах.

Выводы следующие: распространение одной сублинии может быть случайностью, но пока нельзя исключать и преимущество по трансмиссивности. За «российским» вариантом надо наблюдать, отметил Георгий Базыкин.

О разработке ПЦР-тестов для выявления мутаций в гене S-белка вируса SARS-CoV-2, характерных для альфы, беты, гаммы и дельты рассказала Юлия Савочкина (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, Москва ). При выявлении вариантов вируса полногеномное секвенирование наиболее информативно, но не может широко использоваться, и не только по финансовым соображениям: для секвенирования нужны значительные количества копий генома, которые есть не в каждом образце. Поэтому в ФМБА поставили задачу создать ПЦР-набор. «АмплиТест SARS-CoV-2 VOC» сначала распознавал альфу, бету и гамму, во второй версии его дополнили дельтой (подробнее на PCR.NEWS). В наборе используются выпрямленные зонды с LNA-модифицированными основаниями, которые позволяют отличить участок с заменой единственного нуклеотида от такого же участка без мутации.

Аналитическая чувствительность тест-набора — 103 геномных эквивалентов на миллилитр. Диагностическая чувствительность в отношении каждого из вариантов по сравнению с полногеномным секвенированием на приборах Illumina достигает 100%, чтоо было проверено на 1500 образцах. В ФМБА использовали «АмплиТест SARS-CoV-2 VOC» для мониторинга штаммов. С декабря 2020 года по май 2021-го наблюдали рост альфы, позднее начался небольшой рост беты-гаммы (фактически беты). С апреля 2021 года начался рост дельты. Докладчица отметила, что если появятся новые опасные сублинии дельты, набор можно будет дополнить для их выявления.

В последние два года много говорилось о том, что для предотвращения новых пандемий необходим мониторинг вирусов животных. Обнаружение природных очагов SARS-подобных коронавирусов на территории России было темой доклада Сергея Альховского (НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва).

Летучие мыши подковоносы — род Rhinolophus, включающий десятки видов — хорошо известны как резервуар коронавирусов, в том числе SARS-подобных. Они образуют огромные колонии, совершают сезонные миграции и вылеты на кормежку, при этом на дневках разные виды спят бок о бок. В таких условиях вирусу удобно эволюционировать. В Юго-Восточной Азии обитает множество видов летучих мышей, и заметна связь между количеством видов летучих мышей в регионе и эпидобстановкой.

Многие коронавирусы летучих мышей похожи на человеческие SARS-коронавирусы; сходство геномов достигало 75-93%, при этом минимально оно в гене S-белка, что связано с возможностью инфицировать человеческие клетки. Геномы SARS-подобных вирусов мозаичны, и практически в каждом прослеживаются признаки рекомбинационных событий.

Подковоносы обитают и в Европе, и в Азии, и в Северной Африке. На Северном Кавказе и Черноморском побережье встречаются большой, малый, южный подковонос. В прошлом году докладчик с коллегами исследовали летучих мышей Сочинского национального парка, обитающих в пещерах, в подвале Института медицинской приматологии и на чердаках зданий. При анализе мазков изо рта животных и фекалий удалось найти два новых SARS-подобных коронавируса, хотя и не из той же клады, что SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2. Один обнаружили в пещере, другой — в подвале обезьяньего питомника. Самыми близкими их родственниками оказались болгарский и африканский изоляты, причем у одного из «сочинских» вирусов наблюдалось событие рекомбинации. Основная часть его генома схожа с болгарским вирусам, но в гене ORF-7 был участок, близкий к кенийскому изоляту.

Уровень схожести по самым консервативным генам с человеческими коронавирусами не превышал 75%, нет оснований думать, что они могут инфицировать человеческие клетки, но это нужно проверить in vitro.

Исследователи работают с летучими мышами в средствах индивидуальной защиты, но сочинским туристам про эволюцию вируса не объяснишь. Зоологи сочинского парка давно считают, что пещеры надо закрыть для посещений, сказал Сергей Альшанский. Авторы думали о серологических исследованиях людей, летучих мышей и заодно обезьян из Института приматологии, но это пока в дальней перспективе.

Доклад Андрея Комиссарова (НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России) был посвящен секвенированию геномов SARS-CoV-2 в России. Менее чем за два года в мире секвенировано более 5 миллионов геномов нового коронавируса — в 12 с лишним раз больше, чем всех вирусов гриппа, и уже сопоставимо с общим количеством геномов вирусов. Это важно и для фундаментальной науки, и для разработке и апдейта вакцин, и для отслеживания мутаций устойчивости к лекарствам, и для принятия управленческих решений (например, полезно знать, есть ли в регионе более трансмиссивный штамм).

Секвенирование на ранних стадиях пандемии позволяло расследовать вспышки, восстанавливать пути распространения вируса. Еще и сейчас это возможно в Австралии, Новой Зеландии и Китае. После широкого распространения вируса секвенирование аналогичным образом обеспечивает мониторинг новых вариантов.

Ценность генетических данных зависит не только от количества геномов из того или иного региона, полноты и репрезентативности, но и от того, насколько быстро они попадают в базы данных, к которым имеют доступ исследователи. Открытость для анализа — очень острый вопрос, подчеркнул докладчик: кто может анализировать данные, удобно ли это.

Если геномной информацией не делятся, ее ценность снижается. Андрей Комиссаров привел аналогию с Яндекс-картами: чем больше пользователей у приложения, тем точнее и полезнее для каждого из пользователей информация о пробках на дорогах. Так же работают и данные о новых штаммах и их распространенности.

Россия по количеству отсеквенированных геномах в общем доступе занимает 25-е место в Европе, 39-е место в мире; если добавить данные из национальной базы VGARus Роспотребнадзора, то 20-е и 29-е. На сегодня в GISAID около 20 тысяч российских геномов коронавируса и еще около 20 тысяч полных геномов в национальной базе. Для сравнения, абсолютные лидеры, Великобритания и США, секвенировали по миллиону с лишним. Если посмотреть, какая доля от случаев исследована генетически, то по этому показателю Россия окажется на 88-м месте — секвенируется примерно 0,1%. В Великобритании — в 120 раз больше.

Российские данные поступают из множества регионов, хотя лидируют Санкт-Петербург и Москва. Но поступление данных из регионов неравномерно и непостоянно по времени, актуальные данные имеются далеко не отовсюду.

Сколько геномов надо секвенировать, зависит от того, насколько редкий вариант мы хотим найти. Например, если в Санкт-Петербурге регистрируется около 2,5 тысяч новых случаев в сутки, а секвенируется 10–20 геномов в день, можно детектировать варианты, которые встречаются с частотой 10—25%; более редкие выявлены не будут. «Возникают ли новые варианты? Безусловно, да. Но мы их не видим, особенно те, которые эволюционно не успешны», — сказал Андрей Комиссаров.

Секвенирование позволяет методами геномной эпидемиологии расследовать вспышки— такие, как в Институте травматологии Вредена (это вспышку называли «российской Diamond Princess»). В этом расследовании докладчик с коллегами выполнял «мокрую» работу, коллабораторы из Сколтеха и ВШЭ проводили анализ. Но это только одна вспышка из многих

Важно секвенировать вирус в случаях длительного носительство у иммунокомпрометированных больных. Один такой случай был детально проанализирован (подробнее на PCR.NEWS). Этот вариант вируса, накопивший 40 замен, вопреки опасениям, не получил распространения в популяции.

Важна своевременность данных, подчеркнул докладчик. «Ведете автомобиль и видите на лобовом стекле то, что произошло 12 дней назад» — примерно в такой ситуации находятся пользователи баз данных. Своевременность публикации геномов определяется оборотным временем выполнения исследований, от взятия мазка до результата. Большая часть стран укладывается в 14 дней, но есть еще ретроспективное исследование «старых» образцов: оно полезно для научных задач, но не для тактических решений по эпидемиологии.

Возможно, оперативность получение данных могло бы повысить мобильное секвенирование, например нанопоровое.

Андрей Комиссаров также рассказал о российской инициативе по геномам коронавируса CoRGI. По его мнению, секвенирование коронавируса в РФ надо увеличивать в 10-100 раз, расширять сеть лабораторий, налаживать быстрый и беспрепятственный обмен генетическими данными. Национальная база VGARus не очень удобна для анализа, в то же время никто не запрещает депонировать геномы и туда, и в общедоступную базу GISAID.

Марина Дмитрюкова (ООО «НекстБио», Москва) рассказала о разработке теста для дифференциальной диагностики гриппа и COVID-19. (Подробнее на PCR.NEWS.) Различить эти два заболевания по симптомам практически невозможно, а решение о том, назначить ли пациенту осельтамивир или (когда он будет доступен) Паксловид, надо принимать оперативно. Еще в январе 2021 года в России была зарегистрирована тест-система, которая выявляет в образцах и коронавирус SARS-CoV-2, и вирусы гриппа А и В — «АмплиПрайм® SARS-CoV-2/Flu (A/B/H1pdm09)» компании «НекстБио». Докладчица подтвердила, что набор успешно распознает вариант дельта, в том числе эндемичные для России варианты.

Анастасия Лисок, руководитель ПЦР-лаборатории «АлкорБио» (Санкт-Петербург), представила свой набор ОТ-ПЦР-РВ «Интифика SARS-CoV-2». В этом наборе ревертирование и ПЦР проводятся в одной пробирке. Детектируются три специфические мишени в геноме вируса: ORF1ab, ORF8 и N. Набор, помимо обычных положительного, отрицательного и внутреннего контролей, включает эндогенный внутренний контроль — систему праймеров и зонд на кДНК к определенной мРНК человека, которая должна присутствовать в каждом правильно взятом образце. В качестве мишени выбрали транскрипт одного из генов домашнего хозяйства. Такой контроль подтверждает не только правильность выполнения экстракции РНК и ОТ-ПЦР, но и качество взятия мазка (если человеческой РНК в образце нет, возможно, тампон не касался эпителия носа) и соблюдение условий транспортировки. Лизирующий буфер для экстракции должен защищать РНК от окисления и РНКазы.

В «АлкорБио» следят за появлением новых мутаций коронавируса в мире, сказала Анастасия Лисок. К сожалению, в Великобритании появились мутации в праймерах к ORF8: по оценке in silico эта мишень у мутантного штамма не будет выявляться; с остальными мишенями все в порядке. Отвечая на вопрос о том, почему были выбраны три мишени, а не одна консервативная, Анастасия ответила: «Мы выходили на рынок одними из последних, поэтому нам хотелось сделать что-то уникальное». Если набор детектирует три мишени, не может возникнуть непонятная ситуация, когда одна мишень детектируется, другая нет: всегда есть возможность выбора «большинством голосов». Для участка, затронутого мутацией, разработчики сделали альтернативный праймер с вырождением. Тем не менее во время испытаний чаще всего отсутствовал сигнал от ORF8.

Еще об одной теме года — мониторинге естественного и вакцинного иммунитета к SARS-CoV-2 — рассказал Владимир Баклаушев, заместитель генерального директора по научной работе ФГБУ ФНКЦ ФМБА России. По темпам вакцинации Россия отстает от многих других стран, хотя массовая прививочная кампания стартовала еще зимой 2021 года. Чтобы определить уровень защищенности населения, нужен мониторинг иммунного ответа. В первую очередь важны антитела к S-белку (спайку) и N-белку (нуклеокапсиду). Нуклеокапсид высокоиммуногенен, но нейтрализующие антитела, препятствующие проникновению вируса в клетку, — это антитела к определенным участкам спайка. Вирус-нейтрализующая активность сывороток реконвалесцентов коррелирует с концентрацией антител против спайка.

В европейских популяциях через 2-3 месяца после первой волны пандемии наблюдалось в среднем 5% серопозитивных. При этом около 90% переболели в легкой форме, и концентрация антигена у них была недостаточной, чтобы возник мощный клональный ответ. Поэтому естественные вспышки не обеспечивают популяционного иммунитета.

Еще один ключевой вопрос — продолжительность иммунного ответа на SARS-CoV-2. Количество антител в течение года после заболевания снижается, через полгода у многих становится слишком низким. Есть данные о специфичных Т-клетках у переболевших SARS-CoV-1, которые сохранялись и годами. Но насколько они защищают от инфекции, проверить нет возможности. У переболевших новым коронавирусом клеточный иммунитет сохраняется на достаточно высоком уровне 6–8 месяцев.

В Дании попытались выяснить, защищены ли переболевшие от повторного заражения: сравнили, как часто заболевали во время второй волны (в сентябре-декабре 2020 года) те, кто переболел в первую волну, весной 2020 года, и те, кто не болел. В исследовании участвовало более полумиллиона человек. Защита у переболевших составляла 80%, среди лиц старше 65% — только 47%. И это было до прихода дельты.

Иммунизация 60% и более снижает смертность, даже если недостаточно снижает инфицируемость новым штаммом. По всей совокупности имеющихся данных ревакцинация через полгода необходима, отметил докладчик. Сейчас существует много эффективных вакцин, в РФ это прежде всего «Спутник». По «КовиВаку» пока нет опубликованных данных, но исследования аналогичных вакцин других стран позволяют надеяться на хорошую эффективность. Непонятная ситуация с «ЭпиВакКороной»: как сказал Владимир Баклаушев, «эта вакцина способствует получению QR-кода без выработки антител».

Новые штаммы, особенно бета, избегают нейтрализующих антител; чтобы предотвратить заболевание, нужны концентрации антител в три-четыре раза выше, чем те, что считались защитными против старых штаммов. Концентрацию успешно поднимает повторная вакцинация; по некоторым данным, самый лучший иммунитет у тех, кто переболел, а потом ревакцинировался. Очень хорошая схема ревакцинации — аденовирусная вакцина после вакцины на основе мРНК; докладчик выразил надежду, что в РФ скоро появятся РНКовые вакцины.

Снижение концентрации антител через несколько месяцев после вакцинации или болезни — нормальное явление, подчеркнул Владимир Баклаушев. Оно наблюдается и после гриппа, и после аденовирусных инфекций. Когда антитела сохраняются годами, как после рекомбинантных вакцин против гепатита В – это скорее исключение из правил.

 

Информация о докладчиках

Георгий Александрович Базыкин, Сколковский институт науки и технологий, Сколково, ИППИ им. А.А. Харкевича РАН, Москва

Юлия Анатольевна Савочкина, ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, Москва

Сергей Владимирович Альховский, ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва

Андрей Борисович Комиссаров, ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России, Санкт-Петербург

Марина Юрьевна Дмитрюкова, ООО «НекстБио», Москва

Анастасия Валерьевна Лисок, руководитель ПЦР-лаборатории «АлкорБио», Санкт-Петербург

Владимир Павлович Баклаушев, заместитель генерального директора по научной работе ФГБУ ФНКЦ ФМБА России, главный внештатный специалист по КЛД ФМБА России

Добавить в избранное

Вам будет интересно