МД-2023: Point-of-care диагностика

Открыла секцию Людмила Панкратьева (НМИЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева) с докладом «Биомаркеры в дифференциальной диагностике вирусных и бактериальных инфекций в педиатрии: возможности для реализации технологий point-of-care testing». Она сформулировала запрос приборостроителям на изобретение новых систем для быстрой диагностики в педиатрической практике. Point-of-care диагностика (в российских нормативных документах используется термин «исследования по месту нахождения пациента», или ИМНП, в отличие от исследований в лаборатории) особенно актуальна при инфекциях, когда маленькому пациенту в любой момент может стать хуже и действовать нужно быстро. Симптоматика у вирусных и бактериальных заболеваний сходная, поэтому врач не всегда может отличить одно от другого и назначает антибактериальные препараты при вирусной инфекции.

По мнению докладчицы, в педиатрии из двух существующих подходов диагностики инфекций — поиск патогенов и реакция организма — лучше использовать второй, при котором оцениваются биомаркеры организма (цитокины, белки острой фазы), клеточные рецепторы и экспрессия генов. Людмила Панкратьева подчеркнула, что «классические» ПЦР-тесты могут выполняться только в условиях КДЛ, поэтому необходима разработка РОС-систем. На данный момент нет ни одного диагностического маркера неонатального сепсиса, который бы отвечал всем требованиям клиницистов. У врачей есть необходимые лекарства, но их приём откладывается из-за поздней диагностики.

При разработке тестов Людмила Панкратьева предложила использовать в качестве мишеней протеазы, молекулы адгезии, факторы свертывания крови, конечные продукты гликокаликса, эндотелиальные факторы роста и рецепторы. Она также представила дизайн «идеального» РОС-устройства для диагностики инфекций. По мнению Людмилы, в такой тест должны быть включены сенсоры на выявление нуклеиновых кислот и белков возбудителей, биомаркеры для дифференциальной диагностики инфекции или варианта системного ответа на инфекцию. Необходимо высокочувствительное и специфичное РОС-устройство, которое было бы способно определять аналиты за одно исследование из небольшого объема биологической жидкости.

С докладом «Мобильная полуавтоматическая система для выявления ДНК/РНК мишеней методом изотермической амплификации» выступил ведущий инженер-исследователь ООО «Троицкий инженерный центр» Станислав Пауль. В портфеле компании уже есть портативный ДНК-амплификатор для ПЦР-РВ, но проблема выделения нуклеиновых кислот осталась. В 2022 году Центр начал практическую часть проекта по разработке мобильного ДНК-анализатора. В конце года был разработан прототипный прибор РОСТ-5 — алюминиевый корпус, два флуоресцентных канала FAM и Cy5, изотермическая амплификация, картридж с микрофлюидной платформой. В картридже шесть реакционных лунок с возможностью анализа до 12 патогенов одновременно. Для анализа необходим 1 мл раствора с образцом.

В 2023 году работа продолжилась. Был обновлен дизайн, пластиковый корпус заменил алюминиевый, уменьшилась масса прибора и его размеры. Амплификация длится 45 минут. Прибор был отлажен и проверен на человеческой ДНК, бактерии Tannerella forsythia, SARS-CoV-2. Если в образце обнаружен патоген, то светодиодный индикатор на корпусе изменит цвет с синего на красный, если не обнаружен, то на зеленый. Станислав заверил, что на этом Центр не останавливается, возможности прибора будут совершенствоваться и расширяться.

Федор Ширшиков, м.н.с. лаборатории молекулярной медицины Центра молекулярной медицины и диагностики ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России, поставил цель разработать быстрый количественный метод диагностики Mycobacterium tuberculosis.(Об этом он говорил в интервью PCR.NEWS еще в 2021 году.) Сейчас он рассказал о тест-системе ТБ-ИЗАТЕСТ для экспресс-диагностики M. tuberculosis на основе метода LAMP с детекцией в режиме реального времени. Тест-система предназначена для количественного анализа образцов геномной ДНК на базе CFX96 Touch и для качественного скрининга на базе мобильного анализатора ИЗАСКРИН-8.

От стандартной мишени — инсерционной последовательности IS6110, которая используется с 1990-х годов, Федор Ширшиков с коллегами отказались в пользу однокопийного высокоспецифичного гена rv2341. Этот ген активируется при поглощении бактерии макрофагом, что делает возможным детекцию на ранних стадиях заболевания. По словам докладчика, ТБ-ИЗАТЕСТ обладает уникальными характеристиками, превосходящими все известные способы диагностики M. tuberculosis за счет предела детекции порядка 40 геномных эквивалентов на реакцию и малой длительности амплификации (15 минут). Главным ограничением теста Фёдор назвал получение чистой геномной ДНК в воде.

Технология вызвала вопрос у Германа Александровича Шипулина (ЦСП ФМБА России): он поставил под сомнение заявленную чувствительность метода. Федор заверил, что данные точны, такую чувствительность получили после выделения ДНК из клинического материала.

Доклад «Разработка микрофлюидных устройств для биомедицинских применений» представил Антон Букатин (Институт аналитического приборостроения РАН). Микрофлюидные технологии увеличивают скорость и точность анализов, способствуют развитию диагностики в удаленных труднодоступных регионах, реализации новых методик исследования биологических объектов. Антон рассказал, что «Институт аналитического приборостроения РАН» уже умеет делать.

Прежде всего это кремний-стеклянные устройства, которые используются, например, в качестве нанопоровых структур для секвенаторов. Устройства многоразовые, но, к сожалению, дорогие. Полидиметилсилоксан, или ПДМС (силикон в быту) в середине 1990-х совершил революцию в микрофлюидике. Он значительно облегчает жизнь технологам, так как можно один раз сделать кремниевую мастер-форму, а затем по ней отливать силиконовые микрофлюидные чипы. Такие чипы могут быть размером 50х76мм, с глубиной микроканала 1-200 мкм и шириной от 2 мкм. Но из-за того, что ПДМС гидрофобный и со временем меняет свои свойства, массовое производство затруднено.

На чипах возможно выращивать органы, чтобы проводить доклинические испытания лекарств и персональный подбор терапии у пациентов. ИАП РАН разработал методику синтеза гидрогелевых микрочастиц из альгината, полиакриламида, агарозы и PEGMA. В альгинатных частицах выживаемость клеток составила до 80%. Через 1–4 дня клетки образуют клеточные сфероиды, которые затем увеличиваются в размерах в 3–8 раз. Микрочастицы и сфероиды можно использовать для формирования 3D моделей тканей и органов.

Следующим выступил Алексей Субекин (ООО «Фотон-Био») с докладом «Сенсорные ГКР-платформы для детектирования биологических объектов». Спектроскопия комбинационного рассеяния света (рамановская спектроскопия) — это метод оптической спектроскопии, основанный на взаимодействии лазерного излучения с веществом. Он позволяет получить представление о структуре материала или его характеристиках, о внутримолекулярных и межмолекулярных колебаниях. Рамановская спектроскопия дает спектральную характеристику колебаний молекул («молекулярный отпечаток») и применяется для идентификации веществ.

Компания «Фотон-Био» разработала линейку приборов для анализа жидких и твердых образцов. Рамановская спектроскопия хорошо работает только с чистым веществом в достаточном количестве. Это подтолкнуло ученых к созданию безметочных биосенсорных ГКР-систем (ГКР — гигантское комбинационное рассеяние) на основе поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии, при котором вокруг исследуемых молекул локально усиливается электромагнитное поле. С помощью биосенсоров можно обнаружить патогены в монокультуре. Алексей перечислил преимущества разработанных ГКР-сенсоров: низкий предел обнаружения патогенов, измерение занимает меньше часа, в анализе используются недорогие и стабильные реагенты, аптамеры и антитела в качестве узнающих элементов позволяют определять сразу несколько чужеродных агентов.

Тимофей Пылаев (СГМУ имени В.И. Разумовского Минздрава РФ, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Саратовского научного центра РАН) представил доклад «POCT-технологии для генодиагностики на основе гибридных меток наночастиц золота».

Тимофей Пылаев с коллегами разрабатывают альтернативные варианты проведения ПЦР. Одно из таких решений использует плазмонные наночастицы. Эти наночастицы получают из благородных металлов, они характеризуются высоким сечением экстинкции и рассеяния, эффективным термопреобразованием, слабой гено- и цитотоксичностью, иммуногенностью. Возбуждение поверхностных плазмонов происходит при взаимодействии со световой волной. По сравнению с флуоресцентными метками плазмонные наночастицы могут дать больше цветов за счёт изменения размера и/или формы частицы. Сигнал считывается спектрофотометром.

Технологию можно использовать по-разному. Например, можно создать агрегационные колориметрические тест-системы для генодиагностики, при которой гибридизация зонд-мишень индуцирует агрегацию наночастиц золота и изменение окраски раствора. Тимофей рассказал о пилотном проекте применения частиц для быстрой детекции ДНК простейших рода Babesia. Бабезиоз чаще поражает собак, при этом у врача время для постановки диагноза очень ограничено. Ученые успешно определяли наличие искомой ДНК по цвету раствора, что говорит о большом потенциале таких тест-систем. Также Тимофей с коллегами работает над созданием тест-полосок для кардиотропонина — маркёра прединфарктного состояния.

В заключение секции выступил генеральный директор компании «Биодайв» Андрей Тронин. Компания «Биодайв» была создана для разработки портативного экспресс ПЦР-анализатора с одноразовыми картриджами на основе LAMP-ПЦР. Целевая аудитория — ветеринария и сельское хозяйство — далека от ПЦР и диагностики в целом. Поэтому компания попыталась создать такой прибор, который был бы понятен даже тем, кто никогда не был в лаборатории. Прибор «PCRBOT» простой, быстрый (время анализа 30–40 минут), портативный — его можно унести с собой в поле, и дешевый, чтобы его смог купить даже простой фермер. Управление всеми процессами происходит через специально разработанное мобильное приложение.

В картридже 8 ячеек, нуклеиновые кислоты можно выделять на магнитных частицах, стеклянном фильтре или же выбрать режим без выделения, канал считывания один — FAM, аналитическая чувствительность 10⁴ копий НК на 1 мл. «Мы разработали большой картридж — 12 на 8 см — чтобы он не потерялся в траве», — сказал Андрей Тронин. На каждом картридже свой QR-код. Пользователь сканирует его в приложении на телефоне или ПК, и программа получает все необходимые данные для проведения анализа. Технология «PCRBOT» позволяет выявить бактерии, вирусы, паразиты, грибы, мутации и некоторые генетические варианты.

Председатели секции Дмитрий Басманов и Евгений Горский

Секция завершилась дискуссией. Председатель секции Евгений Горский обратил внимание на большое количество школ, занимающихся технологиями РОС, и предложил объединить усилия для достижения наилучшего результата. Ему возразил другой председатель, Дмитрий Басманов, напомнив о важности здоровой конкуренции. С этими словами согласился докладчик Федор Ширшиков, добавив, что при объединении усилий важна специализация, когда одна группа хорошо разбирается в своей области, а другая — в своей.

Герман Шипулин вызвал «малую школу кунг-фу» в лице Федора и его коллег на бой. В лаборатории разработки новых методов молекулярной диагностики заболеваний человека ЦСП ФМБА России сейчас проходит испытание диагностического набора на туберкулез, и Герман Шипулин пригласил Федора Ширшикова протестировать его подход на реальном клиническом материале, чтобы сравнить эффективность разработок. Федор согласился, сказав, что результаты доложат на следующей конференции «Молекулярная диагностика». С нетерпением ждем!

Самая быстрая диагностика

Информация о докладчиках

Людмила Леонидовна Панкратьева, д.м.н., профессор, ГБУЗ г. Москвы №67 им. Л.А. Ворохобова ДЗМ, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Станислав Юрьевич Пауль, ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, ООО «Троицкий инженерный центр»

Федор Владимирович Ширшиков, ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. академика М. Лолухина» ФМБА России, РХТУ им. Д.М. Менделеева

Антон Сергеевич Букатин, к.ф-м.н., ФГБУН «Институт аналитического приборостроения РАН

Алексей Юрьевич Субекин, к.х.н., н.с. МФТИ, ООО «Фотонбио».

Тимофей Евгеньевич Пылаев, к.б.н., Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского Минздрава России, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов ФГБУН ФИЦ «Саратовский научный центр РАН»

Андрей Владимирович Тронин, генеральный директор компании «Биодайв»