Миниатюрная CRISPR-Cas12m модулирует активность генов

С помощью CRISPR-Cas можно редактировать не только геном, но и эпигеном — изменять экспрессию генов, не меняя нуклеотидный последовательности. При этом используются белки dCas (dead Cas), которые не разрезают нуклеотидную цепочку, а только доставляют к участку, комплементарному направляющей РНК, белок. Подавление экспрессии гена может происходить просто за счет связывания белка с мишенью; в клетке микроорганизма подобная система способна отключить ген в составе мобильного элемента и тем самым защитить хозяина. В экспериментальных разработках к dCas могут быть присоединены домены, активирующие транскрипцию гена или отключающие ее, например, за счет метилирования ДНК.

Такое «эпигенетическое CRISPR-редактирование», модулирующее экспрессию генов-мишеней, имеет перспективы терапевтического применения. Например, оно могло бы стать альтернативой генному редактированию, удаляющему из клетки человека активные копии генома вируса гепатита В при хронической инфекции. Однако перед ним стоит та же проблема, что и перед всеми генотерапевтическими методами, основанными на CRISPR-Cas: большой размер белков dCas осложняет их доставку в векторах на основе аденоассоциированных вирусов (AAV). Для создания миниатюрных инструментов эпигенетического редактирования исследователи из Пекинского университета модифицировали белок Cas умеренно термофильной бактерии Pelomicrobium methylotrophicum. Впервые штамм этой бактерии обнаружили российские ученые в образцах из наземного грязевого вулкана на Таманском полуострове (Краснодарский край), они же описали ее как новый вид.

Одна из систем CRISPR-Cas типа V, Cas12m, хорошо подходит для эпигенетического редактирования, поскольку не расщепляет ДНК и прочно связывается с двухцепочечными ДНК-мишенями в клетках человека. (Подробнее о CRISPR Cas12m в статье 2022 года.) Предполагается, что у нее есть многочисленные гомологи небольшого размера в различных таксонах прокариот. Чтобы найти новые маленькие Cas12m, китайские исследователи использовали методы итеративного биоинформатического анализа. Структуры 30 кандидатов получили с помощью AlphaFold 3 и среди них отобрали 15 лучших для функционального тестирования на бактериальных клетках в культуре.

Наиболее эффективным оказался CRISPR-Cas12m из Pelomicrobium methylotrophicum (PmCas12m). Авторы подтвердили его способность блокировать экспрессию генов в E.coli. Специально сконструированный вариант CRISPR-Cas12m также успешно связывался с мишенями в клетках человека. В этом случае авторы не ингибировали, а активировали репортерный ген; для этого использовали PmCas12m, слитую с трехкомпонентным активатором транскрипции VP64-P65AD-Rta (VPR), и направляющую РНК к промотору гена.

Чтобы изучить молекулярный механизм нацеливания PmCas12m на мишень, авторы получили его структуру с помощью криоэлектронной микроскопии. Затем они нашли аминокислотные замены, влияющие на эффективность редактирования, а также выявили участки, делеция которых минимально воздействует на функцию белка. В итоге авторы сконструировали гиперкомпактный вариант xCas12m, состоящий всего из 581 аминокислоты.

Наконец, исследователи создали платформу xCas12m-CRISPRoff. (CRISPRoff — это CRISPR-система, которая доставляет к определенным участкам генома активные домены, вызывающие метилирование ДНК и репрессивные модификации гистонов, и таким образом ингибирует активность определенных генов). Конструкцию нацелили на копии генома вируса гепатита В. Она обеспечила устойчивое подавление активности вируса в клетках in vitro и даже в организме мышей. Примечательно, что ген xCas12m-CRISPRoff вместе с геном направляющей РНК поместился в один AAV-вектор (во многих случаях для доставки приходится использовать два вектора, что снижает эффективность)..

Инъекция терапевтического xCas12m-CRISPRoff через 7 дней после заражения вирусом гепатита В снизила уровни вирусных антигенов и циркулирующей ДНК в крови мышей. Что интересно, снижение после однократной инъекции продолжалось несколько месяцев, то есть эпигенетическая память была устойчивой. Таким образом, xCas12m может стать универсальной платформой для терапевтического редактирования эпигенома, отмечают авторы.

Генная терапия на основе CRISPR-Cas улучшила жизнь пациентов с серповидноклеточной анемией и бета-талассемией