Нанопора с новым адаптером позволяет идентифицировать углеводы, аминокислоты, пептиды и рибонуклеотиды

Нанопоры позволяют секвенировать ДНК и РНК, но пока не белки или гликаны, однако разработки в этом направлении ведутся. Порин A Mycobacterium smegmatis (MspA) используется в нанопоровом секвенировании ДНК. Гетерооктамер MspA более чувствителен к малым молекулам, включая углеводы, нуклеозидмонофосфаты (НМФ) и аминокислоты. Исследователи из Центра инноваций в области химии и биомедицины Нанкинского университета (Китай) предложили новый адаптер для MspA — малеимидо-C2-формилфенилборную кислоту (малеимидо-C2-FPBA). Адаптер вводился в место сужения поры; он нужен, чтобы придать нанопоре способность обратимо взаимодействовать с аминокислотами, НМФ и белками.

Такая измененная нанопора MspA-FPBA обратимо взаимодействует с аминокислотами и их посттрансляционными модификациями (ПТМ), углеводами, пептидами, НМФ и их эпигенетическими модификациями посредством обратимых ковалентных взаимодействий. Так, альфа-аминогруппы аминокислот и их ПТМ, а также N-концевые аминогруппы пептидов взаимодействуют с адаптером FPBA с образованием иминоборонатных соединений. В углеводах, НМФ и других эпигенетических модификациях с адаптером взаимодействуют цис-диоловые группы с образованием борных эфиров. Образование иминоборонатных соединений и борных эфиров обратимо в водных растворах.

Авторы выбрали в качестве модельных аналитов фенилаланин, гуанозин-5'-монофосфат (ГМФ) и D-фруктозу. Нанопора быстро детектировала фенилаланин. При этом детекция происходила еще лучше, если pH буферов по разные стороны поры различались. Сигнал были разными, когда через пору проходили фенилаланин, ГМФ или D-фруктоза. Все сигналы от нанопоры были описаны количественно.

На следующем этапе авторы детектировали с помощью нанопоры 21 аминокислоту, составляющую белки (включая селеноцистеин), канонические НМФ (АМФ, УМФ, ЦМФ и ГМФ) и четыре случайные углевода.

MspA-FPBA эффективно дифференцировала 21 протеиногенную аминокислоту. Примечательно, что MspA-FPBA однозначно отличала лейцин от его изомера изолейцина, что является сложной задачей для обычной масс-спектрометрии. С помощью модели машинного обучения нанопора идентифицировала несколько типов аминокислот, НМФ и углеводов из смеси.

На модельных аналитах авторы продемонстрировали способность нанопоры идентифицировать ПТМ (N6-ацетил-лизин, O-фосфо-тирозин, N3,N4-диметил-аргинин) и модифицированные НМФ (псевдо-УМФ, N6-метил-АМФ, инозин-5′-монофосфат). То же было показано на коротких пептидах.

Исследователи предположили, что нанопору также можно будет использовать для анализа аминокислотного состава и модификации гликозилирования на пептидах и белках. Они синтезировали пептид Гли-Мет-Глн-Арг-Асн-(N-Ацетилглюкозамин)-Иле-Сер. Его гидролизовали с помощью лейцинаминопептидазы, которую затем удалили из смеси. Нанопора успешно идентифицировала Гли, Мет, Глн и Арг, а также обнаружила три типа ранее неидентифицированных событий. Эти события исчезают, если детектировать негликозилированный пептид. Так что они возникают, скорее всего, при детекции фрагмента Асн-(N-Ацетилглюкозамин)-Иле-Сер. Без ферментативного расщепления детектируется только одно событие от связывания N-концевой аминогруппы пептида с адаптером.

Экстракт дрожжевых клеток богат нутриентами, так что авторы опробовали работу нанопоры на нем, с помощью ультрафильтрации убрав макромолекулы. Аминокислоты, НМФ, углеводы и пептиды были классифицированы автоматически с помощью модели машинного обучения. Также нанопору опробовали на природном комплексе N-гликопептидов, выделенном из яичного желтка.

Таким образом, авторы продемонстрировали возможности MspA-FPBA анализировать широкий спектр аналитов, включая 21 протеиногенную аминокислоту, аминокислоты с посттрансляционными модификациями, канонические НМФ, эпигенетически модифицированные НМФ, моносахариды и пептиды. Интеграция модели машинного обучения позволила достичь общей точности в 98,7%.

Нанопоровое секвенирование выявляет миРНК, белки и малые молекулы в сыворотке крови