Что важно знать о подготовке библиотек для NGS

Протоколы подготовки проб варьируют в зависимости от образца, необходимой нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и цели эксперимента. Дополнительные «измерения» добавляют различные производители — у каждого свои требования к библиотекам.

Если говорить о секвенировании второго поколения в России, прежде всего следует рассмотреть инструменты компаний Illumina, MGI, Ion Torrent. (Платформы для получения длинных ридов, такие как Pacific Bioscience и Oxford Nanopore имеют свою специфику пробоподготовки.) Исторически платформа Ion Torrent первой появилась в РФ благодаря деятельности Thermo Fisher Scientific, однако затем было установлено значительное количество приборов Illumina. В последнее время на российском рынке активно распространяется продукция MGI и других китайских производителей.

Подготовка ДНК или РНК для NGS обычно состоит из следующих этапов:

• экстракция нуклеиновой кислоты,

• если речь идет о РНК — обратная транскрипция,

• подготовка библиотеки,

• контроль качества.

Что представляет собой NGS-библиотека? По сути, это пул фрагментов ДНК, подготовленных для секвенирования. Длина фрагментов должна попадать в определенный диапазон, чтобы соответствовать поставленной задаче и возможностям платформы, на которой будет проводиться секвенирование.

Фрагментацию длинных молекул ДНК до подходящего размера проводят с помощью физических или ферментативных методов. Распространенный физический метод — фрагментация ультразвуковым облучением; также могут использоваться гидродинамические и электромагнитные воздействия. Ферментативные методы обычно предполагают применение эндонуклеаз рестрикции.

К фрагментам необходимо лигировать адаптеры — технические последовательности, которые делают возможными манипуляции с молекулами ДНК. Перед этим проводят восстановление концов двунитевых молекул, чтобы на них не было однонитевых участков, фосфорилирование 5’-концов и аденилирование 3’-концов. Адаптеры обеспечивают прикрепление молекулы к поверхности твердой фазы, клональную амплификацию фрагмента и протекание реакции секвенирования. Каждый адаптер содержит участок, комплементарный олигонуклеотиду в проточной ячейке, а также молекулярный маркер — индекс в случае платформы Illumina, баркод в случае платформы Ion Torrent. Индексы позволяют отличить один образец от другого и делают возможным мультиплексирование — секвенирование нескольких образцов в одной проточной ячейке прибора. Чтобы предотвратить «перескок» — обмен индексами во время секвенирования между фрагментами разных библиотек — можно использовать уникальные двойные индексы (UDI).

Большинство протоколов подготовки библиотеки включают этап амплификации, которая увеличивает количество ДНК. Однако на этом этапе зачастую искажается состав образца, изменяются относительные количества тех или иных фрагментов, что неприемлемо для многих задач. Могут также накапливаться ошибки из-за неточной работы полимеразы и ПЦР-артефакты (такие, как «химеры», возникшие при переключении матрицы).

Некоторые компании предлагают специальные наборы для амплификации, снижающие искажения. Кроме того, адаптеры могут включать уникальные молекулярные идентификаторы (UMI), позволяющие отследить «судьбу» каждого фрагмента. Существуют протоколы подготовки библиотек без амплификации. Такие протоколы обычно требуют больших количеств материала, но хорошо подходят, например, для исследования промоторных и регуляторных областей генома, в которых много GC- и AT-богатых участков, а также для полногеномного секвенирования, выявления однонуклеотидных полиморфизмов и небольших инсерций/делеций.

Этапы подготовки для разных платформ до этапа лигирования адаптеров в целом сходны; возможность использовать библиотеку на той или иной платформе определяется именно адаптерами.

Тагментация — альтернативный подход к подготовке библиотеки от Illumina, при котором специально модифицированная транспозаза (transposome) используется и для фрагментации ДНК, и для лигирования адаптеров — эти этапы объединяются в один. Данный подход облегчает и ускоряет работу, позволяет получать единообразные по размеру фрагменты, а также снижает необходимое количество исходной ДНК.

Таким образом, подготовка библиотеки — это, как правило:

• фрагментация и селекция фрагментов по размеру (с помощью электрофореза или магнитных частиц),

• лигирование адаптеров,

• амплификация (может быть исключена).

Контроль качества библиотеки — ключевой шаг к высококачественным данным NGS. Для контроля используются методы на основе спектрометрии, флюориметрии, электрофореза, в том числе с применением автоматизированных систем.

 Credit: National Cancer Institute

Помимо количества нуклеиновой кислоты и отсутствия примесей, способных ингибировать реакции секвенирования, важный параметр библиотеки — ее сложность, или количество уникальных фрагментов ДНК; другими словами, библиотека должна максимально точно отражать исходный материал. Снижение сложности, как уже говорилось, обычно происходит за счет ПЦР-амплификации во время подготовки библиотеки.

До сих пор обсуждалась подготовка библиотеки линейных фрагментов. Для работы на приборах MGI требуется циркуляризация NGS-библиотеки — из линейных фрагментов создаются кольцевые. Технология DNA nanoball sequencing, разработанная в Complete Genomics и усовершенствованная в Пекинском институте геномики (BGI), предполагает амплификацию по механизму катящегося кольца. Фрагменты библиотеки лигируются в кольцо вместе с адаптерами, комплементарными олигонуклеотиду-праймеру, и в результате амплификации высокоточной ДНК-полимеразой Phi29 образуются конкатемеры — длинные молекулы, содержащие последовательно расположенные копии фрагмента. Такие молекулы образуют «наноклубки» (DNA nanoballs), которые располагаются на чипе, отсюда названия и линейки приборов — DNBSEQ. Наноклубок — по сути, аналог кластера линейных молекул в других платформах, но его получают в пробирке, что позволяет проверить библиотеку после амплификации и до загрузки на ячейку. В отличие от других методов амплификации, при образовании наноклубков не происходит накопления ошибок в циклах (матрица всегда одна и та же). Исключаются искаженная представленность различных фрагментов в библиотеке и неравномерность покрытия из-за разного нуклеотидного состава тех или иных участков.

Требования к NGS-библиотеке определяют также типы и задачи секвенирования.

• Полногеномное секвенирование предполагает определения всей последовательности ДНК-генома организма. Полноэкзомное секвенирование — секвенирование экзома, то есть всех кодирующих белки участков генома. Для этого требуется обогащение участков ДНК с экзонами. Оно может выполняться с помощью мультиплексной ПЦР или гибризидации с зондами, специфичными к экзонам. Экзом составляет всего 1–2% человеческого генома, при этом в нем находится подавляющее большинство известных мутаций, ассоциированных с заболеваниями.

• Целевое (таргетное) секвенирование ограничено определенными областями генома, выбранными под задачи исследования, что делает его относительно дешевым; в этом случае также используется обогащение библиотеки.

• Задача бисульфитного секвенирования — изучение паттернов метилирования ДНК. Для этого выполняется бисульфитная конверсия — геномная ДНК денатурируется (делается одноцепочечной) и обрабатывается бисульфитом натрия, что приводит к дезаминированию неметилированных цитозинов и их превращению в урацилы, в то время как метилированные цитозины (5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин) не модифицируются. Затем ДНК амплифицируют с помощью ПЦР, при этом урацилы превращаются в тимины. Данный метод используют для выявления эпигенетических модификаций и редких событий метилирования.

• Секвенирование РНК позволяет анализировать транскриптом — набор всех кодирующих и некодирующих транскриптов, то есть исследовать посттранскрипционные модификации, слияния генов, мутации и изменения в экспрессии генов. При подготовке образца проводят обратную транскрипцию РНК, чтобы получить комплементарную ДНК (кДНК). Важный этап подготовки библиотеки — удаление рибосомной РНК, которая обычно преобладает в образце.

• Секвенирование РНК единичных клеток позволяет оценить транскрипционные различия между отдельными клетками, идентифицировать редкие клеточные популяции, которые могли остаться необнаруженными при суммарном анализе экспрессии генов, например, в опухолевой массе. Таким образом можно исследовать уникальные клетки, такие как Т-лимфоциты с Т-клеточными рецепторами определенных типов. Поскольку в каждой клетке экспрессируется относительно небольшая доля генов, и большинство транскриптов представлено несколькими копиями, стоимость проведения секвенирования РНК единичных клеток намного меньше, чем, например, у полногеномного секвенирования. Подготовка клеток для библиотек в этом случае требует особого подхода.

Таким образом, ни один протокол подготовки не является оптимальным для всех случаев, но можно найти оптимальный протокол для каждой конкретной задачи. Разнообразные наборы для создания NGS-библиотек доступны на ручной подготовке, а также на станции для автоматизированной подготовки библиотек.

 Credit: National Cancer Institute

Реагенты для подготовки NGS-библиотек производит китайская компания Vazyme Biotech. Она возникла как стартап в 2012 году и быстро развилась в крупную компанию с собственным производством. Портфель ее продуктов включает более 600 наименований. Начиная с прошлого года продукция Vazyme доступна на территории Российской Федерации.

В ассортименте — продукты для каждого этапа подготовки библиотеки на платформах для Illumina, MGI, Ion Torrent. Это реагенты для секвенирования ДНК и РНК, разнообразные наборы для мультиплексирования библиотек, для контроля качества (количественного анализа) в форматах модуля, набора и отдельного компонента.

Так, например, универсальный набор для подготовки библиотеки ДНК VAHTS для Illumina V4 преобразует в библиотеку 100 пг-1 мкг фрагментированной двухцепочечной ДНК Обновленная версия нового поколения повышает коэффициент конверсии низкокачественных матричных библиотек шаблонов и снижает частоту повторности за счет оптимизации и улучшения модуля восстановления концов, модуля присоединения и модуля амплификации библиотеки. Этот набор подходит для подготовки библиотеки из широкого разнообразия образцов, с применением ПЦР или без него, и совместим с процессом таргетного захвата. 

Компания SkyGen предлагает вашему вниманию полный ассортимент продуктов Vazyme для пробоподготовки NGS-библиотек, а также проводит акцию на товары Vazyme с истекающим сроком годности, которые можно приобрести с большой скидкой.

Партнерский материал