Павел Сольев: «Подавлять ферменты бактерий нужно с умом»

Блок, посвященный бактериям, завершил Павел Сольев (к.х.н., ведущий научный сотрудник, руководитель лаборатории химической регуляции биокатализа Института молекулярной биологии РАН) с лекцией «Как бактерии научились использовать серу для выживания».

Роль серы для жизни

Сера — незаменимый макроэлемент, который выполняет важные функции в организме живых существ. Как и другие элементы 3 периода периодической системы, она способна образовывать стабильные соединения сразу в нескольких степенях окисления и образовывать кислородсодержащие кислоты. Основной первоисточник серы в природе – вулканическая активность, встречается она и в составе многих минералов, к примеру, в виде пирита (FeS₂) — «золота дураков». Этот макроэлемент отличается высокой мобильностью в почве и водах, а также может быть усвоен микроорганизмами из газов.

Хорошо известно, что бактерии отличаются очень разнообразным метаболизмом. В природе микроорганизмы умеют окислять серу постадийно, переходя последовательно через несколько анионов от сульфидов к сульфатам. Сероокисляющие бактерии обитают, например, в океане, где занимают разные слои воды, отличающиеся по содержанию кислорода. Считается, что такая стратификация связана с тем, что по мере эволюции Земли и обогащения атмосферы кислородом в древние времена бактериям приходилось приспосабливаться к новым условиям среды и осуществлять кооперативный обмен продуктами метаболизма между собой.

Биогеохимические циклы фосфора и азота отличаются некоторой простотой: фосфор в виде фосфатов «путешествует» из растений в животных, из животных в почву, затем в водоемы и снова в растения или минералы. В цикл азота, в свою очередь, включены только нитраты, нитриты и аммиак (аммоний). Биогеохимический цикл серы более сложный, так как включает в себя множество разных соединений серы, а также взаимодействия с различными переходными металлами — особенно железом и марганцем — и метаном. Основные взаимодействия серы с металлами и метаном происходят на большой глубине под землей, где концентрации кислорода очень низки.

Под действием почвенных микроорганизмов сульфат может восстанавливаться до сульфида, при этом метан окисляется до гидрокарбоната. При восстановлении сульфата бактерии затрачивают АТФ и запасают серу, встраивая ее в другие соединения. Например, они могут синтезировать сульфит глутатиона (S-сульфоглутатион) — молекулу, которая участвует в поддержании окислительно-восстановительного баланса. Из производных глутатиона можно получать сульфиты и восстанавливать их до сульфидов, а в такой форме серу можно встраивать в аминокислоты — например, в цистеин. У животных сера и её аминокислоты участвуют в более сложных механизмах, отвечающих за сенсорные свойства — чувствительность органов обоняния и осязания к газам и к сигнальным молекулам в окружающей среде. Образование дисульфидных мостиков служит основой некоторых сигнальных путей, обеспечивающих репарацию ДНК, релаксацию мышц, расширение сосудов и многие другие процессы.

Проблема антибиотикорезистентности

Согласно прогнозам ВОЗ, к 2050 г. проблема антибиотикорезистентности станет особенно острой: не останется микроорганизмов, чувствительных к антибиотикам. При этом разработка новых антибиотиков занимает около 10 лет и оценивается в суммы порядка 1 млрд долларов. Сам по себе процесс разработки новых антибиотиков экономически невыгоден: уже через 5–7 лет после вывода препарата на рынок появятся устойчивые к нему штаммы бактерий. Усугубляет ситуацию также то, что резистентные штаммы распространены по миру неравномерно: в России больше представлены резистентные Acinetobacter baumannii и Mycobacterium tuberculosis, а устойчивые к лекарствам кишечная палочка и золотистый стафилококк чаще встречаются в Америке и Азии. При этом карта резистентных штаммов постоянно меняется, что связано с их миграцией и передачей генов устойчивости новым штаммам.

Как же в таком случае бороться с антибиотикорезистентностью? Одна из стратегий состоит в поиске генов, отвечающих за устойчивость или чувствительность бактерии к препаратам. Для этого из коллекции штаммов микроорганизмов выбирают чувствительные и резистентные к препаратам бактерии, подвергают их полногеномному секвенированию, и находят те гены, которые изменили свой уровень в результате приспособления к препарату. Выбранные гены отвечают за экспрессию белков — потенциальных мишеней для новых препаратов, которые могут применяться в комбинации с основными антибиотиками как их потенциаторы.

Потенциаторы — помощники антибиотиков

Выделяют группу ферментов, которые участвуют в синтезе серосодержащих аминокислот, таких как цистеин, метионин и некоторые другие. Ферменты, участвующие в ассимиляции серы в аминокислоты — как протеиногенные, так и промежуточные —схожи в структурном устройстве и зависят от кофактора — пиридоксаль-5’-фосфата, (также известного как витамин B6), но среди царств организмов они представлены неравномерно. Некоторые из этих ферментов есть только у человека и грибов, большинство же встречается у бактерий и отсутствует в организме человека. Например, известно, что цистатионин-β-синтаза служит у человека и грибов для синтеза цистатионина, в то время как у бактерий и растений в этом процессе задействована цистатионин-γ-синтаза, которая отсутствует у человека. В открытие механизма действия этой группы ферментов и доказательство влияния кофактора большой вклад внес А.Е. Браунштейн, описавший в 1952 г. совместно с М.М. Шемякиным механизм пиридоксальфосфат-зависимого катализа. Современная энзимология занимается уточнением функций и специфичности ферментов, внося новые данные по путям метаболизма и уточняя назначение каждого из ферментов в международных базах данных.

Подавлять ферменты, участвующие в синтезе серосодержащих аминокислот у бактерий, нужно с умом. Часть из тех же химических превращений, которые происходят в клетках бактерий, важны и для метаболизма человека. Например, некоторые из ферментов синтеза серосодержащих аминокислот у человека экспрессируются только в мозге, и нарушение их работы может привести к развитию нейродегенерации или деменции. Также нельзя полностью блокировать биохимический цикл метионина, так как эта аминокислота служит стартовым кодоном при синтезе белка, важна для метилирования и других процессов.

Предположительно, мишенями в клетках бактерий могли бы послужить цистатионин-γ-лиаза, цистатионин-β-синтаза и 3-меркаптопируватсульфотрансфераза. Российские ученые из Института молекулярной биологии РАН и НТУ Сириус (группа Е. Нудлера, Р.А. Иванов) предлагали панель новых соединений — потенциаторов антибиотиков, ингибирующих цистатионин-γ-лиазу. Эти ингибиторы называются неконкурентными или аллостерическими — они не связываются с активным каталитическим центром фермента, но все равно блокируют его работу, мешая подступиться субстрату белка для превращения в продукт. Благодаря этому ингибиторы действовали более селективно на функцию бактериальных ферментов, чем на ферменты человека. Для проведения этой работы потребовалось применить методы генной инженерии, молекулярной биологии и химии, а также протестировать препараты in vitro — на бактериях и клетках и in vivo — на животных.

После публикации этой работы эксперименты продолжились: дополнительные модификации молекул после построения фармакофорной модели позволяют улучшить их свойства. При этом сами по себе потенциаторы никак не влияют на рост бактерий, но подавляют его совместно с другими антибиотиками, такими как гентамицин. Такое синергидное усиление противомикробной активности позволяет использовать старые и уже малоактивные классы антибиотиков для борьбы с распространением устойчивых к ним штаммов.

Сера и ферментативный биокатализ

Ферменты, участвующие в синтезе серосодержащих аминокислот, также нашли применение в биокатализе. Например, метионин-γ-лиазу можно использовать для превращения неактивных веществ в активные противомикробные агенты. К их числу относится класс тиосульфинатов — они также содержатся в чесноке, луке, капусте и некоторых других растениях, и обладают противомикробными свойствами. Если тиосульфинат получать просто методом органического синтеза, то время его жизни недостаточно высоко, поэтому требуется на порядок более концентрированный раствор для подавления роста бактерий. А вот расщепление его предшественника ферментом позволяет добиться высокой активности и повышенной концентрации тиосульфината, благодаря чему он может эффективно бороться с патогенами. Тиосульфинаты также могут служить потенциаторами антибиотиков. Они повышают эффективность амфотерицина, флуконазола, 5-флуцитозина.

Но как использовать такую систему генерации тиосульфинатов с помощью фермента в организме? Если вводить его инъекцией или потреблять перорально, то фермент быстро разложится. Исследователи предложили заключить метионин-γ-лиазу и сульфоксиды в нанокапсулы — полимерные везикулы. Состав везикулы подобран таким образом, что при попадании в организм фермент может сохраняться внутри везикулы в течение суток. При этом везикула полупроницаемая, то есть в нее может проникать пролекарство — субстрат для фермента, а наружу из везикулы может выходить сам тиосульфинат. В экспериментах in vitro и in vivo такой препарат, представляющий собой фармакологическую пару, показал противомикробную, противовирусную и противоопухолевую эффективность.

Стоит учесть, что сами тиосульфинаты могут окислять тот же фермент, что их произвел — метионин-γ-лиазу, так как в нем содержатся цистеины. Чтобы преодолеть это препятствие, ученые модифицировали фермент так, чтобы заменить все цистеины и сделать его устойчивым к действию тиосульфината. Модифицированный фермент может сохранять активность в течение месяца.

Ферменты, участвующие в синтезе серосодержащих аминокислот, нашли важное применение и в сельском хозяйстве. Например, в Китае О-ацетилгомосеринсульфгидрилаза используется в промышленном биокатализе для получения метионина — он добавляется в корма животных и в удобрения для растений. В отличие от химического синтеза, продуктом которого является смесь энантиомеров, ферментативный биокатализ позволяет получить только один из энантиомеров.

Необычные серосодержащие аминокислоты

Таурин — еще одна серосодержащая аминокислота — известен многим в комбинации с кофеином, способствующей бодрствованию. Таурин входит в состав глазных капель, которые применяли для преодоления так называемого «синдрома китайского ресторана» — гипотетического набора симптомов, с которыми некоторые люди сталкиваются после употребления блюд китайской кухни. Возникновение этих симптомов ранее связывали с глутаматом натрия, который активно использовался в качестве пищевой добавки в азиатской кухне для придания пятого основного вкуса – умами. Тем не менее, глутамат повышает концентрацию ионов кальция на мембране и в больших количествах может нарушать передачу нервных импульсов, в том числе в ближних слоях сетчатки. Таурин является антагонистом глутамата и помогает восстановить нервную передачу после индуцированной глутаматом деполяризации мембраны нейронов. Помимо этого, таурин участвует в поддержании гомеостаза кальциевых ионов, ингибирует апоптоз и регулирует клеточный осмос. Он также входит в состав одной из основных желчных кислот — таурохолевой кислоты, которая поддерживает баланс в пищевой системе человека для вывода токсинов и сложно перерабатываемых компонентов в печень и далее в кишечник, где конъюгат с таурином снова разрушается на исходные составляющие благодаря жизнедеятельности кишечных бактерий.

Гомоцистеин и гомосерин — другие примеры серосодержащих аминокислот, которые не используются для строительства белков, но играют важную сигнальную роль. Размер боковой цепи этих двух аминокислот предрасполагает к тому, чтобы они самоциклизовались при изменении нейтральной среды на более кислую, не только в природе, но и в химической лаборатории. Бактерии научились использовать циклические молекулы из этих аминокислот и из родственного по структуре орнитина — лактоны и лактамы, которые обеспечивают им чувство кворума, т.е. кооперативное взаимодействие бактерий. Опираясь на чувство кворума, бактериальная колония может «понять», что вокруг неблагоприятные условия и нужно менять свое поведение соответствующе, запускать систему защиты и экспрессировать гены белков, функции которых ранее были не нужны в благоприятной среде. Так, если колония «чувствует» определенные сигнальные молекулы хотя бы от одной бактерии, то вся колония как по команде может начать образовывать биопленки — в таком виде бактериям легче выжить. Соответственно, на эти сигнальные молекулы чувства кворума можно нацелиться в поиске кандидатов в препараты, способных бороться с бактериальными биопленками.