В регуляторных областях нейронов накапливаются вставки и делеции

Перспективная стратегия обнаружения соматических мутаций — прямое секвенирование ДНК единичных клеток (single-cell DNA sequencing, scDNA-seq). Перед секвенированием нужно провести точную и равномерную амплификации генома клетки, а это отдельная проблема. Один из самых распространенных методов — амплификация с множественным замещением цепи (multiple displacement amplification, MDA) — может приводить к аллельному дисбалансу, если гомологичные аллели диплоидных клеток будут амплифицироваться с различной скоростью. Недавно разработанный метод, известный как направленная на первичную матрицу амплификация (primary template-directed amplification, PTA), срабатывает лучше, что еще раз подтвердила международная группа ученых, которая сравнила два протокола на отдельных нейронах префронтальной коры (ПФК) одних и тех же людей.

Ученые из США, Бельгии, Южной Кореи и Нидерландов провели исследование scDNA-seq, используя метод PTA. Они амплифицировали геномы 52 одиночных нейронов ПФК, выделенных из замороженных посмертных тканей головного мозга 12 здоровых людей, среди которых были младенцы и взрослые. Эти данные были объединены с уже опубликованными результатами секвенирования 15 нейронов 5 людей. Тот факт, что у 11 из 17 человек 75 одиночных нейронов были ранее амплифицированы с помощью MDA, и позволил прямо сравнить два протокола.

Полученные результаты указывают на гораздо более низкое число артефактов однонуклеотидных вариантов (SNV) при амплификации с помощью PTA. Ученые сосредоточились на младенцах, чьи нейроны содержат наименьшее количество возрастных мутаций. Ожидалось, что именно в них доля артефактов MDA окажется наибольшей. Так, соматические SNV из нейронов младенцев, амплифицированных MDA, были примерно в 10 раз более многочисленными (282 против 26 SNV на нейрон) по сравнению с таковыми из нейронов, амплифицированных PTA.

Далее ученые применили разработанный ими генотайпер SCAN2 (single-cell analysis 2) для обнаружения SNV, а также небольших инделов (вставок и делеций) в одиночных клетках. Важно отметить, что алгоритм работает только с образцами, амплифированными с помощью PTA. Так, оценив 52 PTA-амплифицированных нейрона, ученые обнаружили, что за год в аутосомах нейронов человека накапливается 16,5 соматических SNV с сигнатурой А, которая состоит в основном из мутаций C>T и T>C. SCAN2 также идентифицировал 1541 индела, число которых увеличивается на 3 в год, что сходно со скоростью, наблюдаемой в нескольких митотически активных типах клеток. Делеции накапливались в 3,3 раза быстрее, чем вставки, а размеры инделов варьировались от -29 пар нуклеотидов (п.н.) до +17 п.н.

Высокая чувствительность метода PTA и SCAN2 позволила выявить, что в большей степени соматическими SNV и инделами обогащены промоторы и промоторно-дистальные энхансеры, которые, как сообщалось, показывают повышенные уровни повреждения и репарации ДНК, а также двухцепочечных разрывов в нейронах. Судя по всему, инделы в элементах, регулирующих гены, оказывают значительное влияние на целостность генома в нейронах человека.

В целом авторы надеются, что стратегия scDNA-seq вместе с протоколом PTA и алгоритмом SCAN2 позволит решать разнообразные задачи, включая анализ соматических мутаций нейронов у людей с нейродегенеративными заболеваниями, дальнейшую характеристику мутаций, вызванных воздействием мутагенных соединений, а также измерение эффективности и точности CRISPR для редактирования на уровне отдельных клеток.

Новый метод секвенирования позволяет одновременно изучить метилом, транскриптом и доступность хроматина единичных клеток

Найден новый ген, связанный с дегенерацией мотонейронов у человека