«Новый резистентный штамм туберкулеза», или Много шума из ничего

Что за статья?

Статья исследователей из Дублина (Ирландия), опубликованная в npj Antimicrobial Resistance, называется «Эволюция и глобальное распространение клады Mycobacterium tuberculosis с признаками пре-широкой лекарственной устойчивости, сформировавшейся в Белоруссии». Ирландские исследователи проанализировали 1362 генома родственных штаммов, принадлежащих к одной из филогенетических линий M. tuberculosis из открытых баз данных, чтобы изучить распространение и генетические связи лекарственно‑устойчивых изолятов, ранее выявленных преимущественно в Белоруссии. На основе филогенетического анализа они выделили крупную лекарственно-устойчивую кладу (ветвь) и назвали ее EurA1 — «евразийской» кладой, поскольку изоляты были обнаружены в странах Европы и Евразии. Внутри EurA1 авторы выделили субкладу EurA1.1 из 387 изолятов. Среди них 228 изолятов имели пре-широкую лекарственную устойчивость (пре-ШЛУ), то есть устойчивость к стандартным препаратам первого ряда, таким как рифампицин, а также к фторхинолонам. Из Белоруссии происходили 172 пре-ШЛУ штамма.

Эту кладу, выявленную на основании полногеномного анализа, авторы связали со сполиготипом SIT266, ранее описанным как пре-ШЛУ вариант, характерный для Белоруссии (там он составляет 30% устойчивой популяции). (Сполиготипирование — простой метод генотипирования возбудителя туберкулеза, основанный на анализе структуры локуса CRISPR, изменчивой у M. tuberculosis. При всех своих недостатках он пригоден для грубого первичного субтипирования штаммов, удобен для визуализации в виде бинарных черно-белых профилей и хранения в глобальных базах данных).

Генетически близкие изоляты EurA1.1 были обнаружены не только в Белоруссии, но также в России, Украине, Грузии, Молдове, Германии, Великобритании и других странах.

Глобальный характер науки означает, что любой исследователь может писать о чем угодно. Вполне нормально, что авторы из Ирландии пишут о Белоруссии, и они объясняют, почему их заинтересовали изоляты из этой страны: «В Белоруссии регистрируются одни из самых высоких в мире показателей заболеваемости лекарственно-устойчивым туберкулезом (ЛУ-ТБ), причем значительная доля случаев обусловлена штаммами линии 4 (сполиготип SIT266). Ранее предполагалось, что распространение этих изолятов ограничено территорией Белоруссии, однако исследований с применением полногеномного секвенирования (WGS), посвященных оценке их международного распространения, до сих пор проводилось крайне мало».

И далее:

«В ходе предыдущего исследования мы определили популяционную структуру лекарственно-устойчивого туберкулеза (ЛУ-ТБ) в Ирландии и обнаружили, что многие изоляты ЛУ-ТБ были тесно связаны с изолятами, входящими в крупные международные сети передачи инфекции, центры которых находились за рубежом. Одна из таких сетей включала крупную кладу лекарственно-устойчивых штаммов, относящихся к линии 4.3.3; при этом большинство изолятов данной группы было получено в Белоруссии».

Что за клада EurA1.1, почему раньше о ней никто не слышал, хотя, получается, она распространена по всей Европе?

К сожалению, авторы статьи, в основном работающие с кишечными бактериями, пошли по пути придумывания своей номенклатуры, хотя уже 12 лет как развивается международная номенклатура SNP-баркодирования M. tuberculosis, в том числе и при значительном вкладе российских ученых, а именно Егора Шитикова и его группы. Согласно общепринятой номенклатуре, эта клада EurA1.1 относится к генотипу LAM (L4.3) и его ветви L4.3.3 (иначе называемой LAM-RUS, когда-то обнаруженной в России, а сейчас ясно что она исторически циркулирует в Европе и Северной Евразии).

Популяция M. tuberculosis включает 10 филогенетических линий, наиболее известны Восточно-Азиатская (или Линия 2) и ее главный компонент — генотип Beijing (L2.1). Но не менее значима внутренне разнообразная Линия 4, а входящий в нее генотип LAM (Latin American Mediterranean, L4.3) почти так же «популярен» как Beijing. Штаммы той и другой линии распространены в России, хотя LAM несколько больше присутствует в Европейской части страны.

Авторы скачали общедоступные геномы из баз данных, сделали их анализ, построили дерево, проследили откуда эти штаммы. Новизна исследования в том, что показано обособленное положение ветви EurA1.1 внутри дерева, а также то, что эти штаммы по большей части ассоциированы с пре-ШЛУ и МЛУ, и определен профиль мутаций устойчивости и потенциально важных мутаций в генах репарации.

Действительно, как отмечают сами авторы, эта клада EurA1.1 примерно соответствует давно описанному сполиготипу SIT266. Про него также давно известно, что он один из основных мультирезистентных и пре-ШЛУ генотипов M. tuberculosis в Белоруссии.

«Этот сполиготип эпизодически выявлялся в России и Латвии, однако преимущественно ассоциировался со случаями лекарственно-устойчивого туберкулеза в Белоруссии», — пишут авторы.

Значит, в России тоже есть эта клада EurA1.1 или сполиготип SIT266?

Есть, но она встречается еще более «эпизодически», чем указано в статье на данный момент (на сайте журнала пока опубликован предварительный вариант).

Дело в том, что авторы допустили несколько неточностей (мы обратили их внимание, и они обещали исправить). В ходе извлечения информации из баз данных при оценке российских геномов они не отделили клинические изоляты от экспериментальных изолятов, полученных из зараженных мышей в нашем исследовании патогенности мультирезистентных штаммов и их адаптаций к терапии (подробнее об этой работе на PCR.NEWS). Кроме того, для некоторых штаммов была ошибочно атрибутирована страна происхождения. С учетом этих неточностей остается только три изолята SIT266 из кластера EurA1.1, действительно происходящих из России. То есть речь идет о совершенно ничтожной цифре.

В то же время надо понимать, что этот результат получен на основании тех геномов, которые депонированы. Базы геномных данных часто перенасыщены наиболее значимыми резистентными штаммами — зачастую секвенируют не все подряд, а только самое значимое. Но такая избирательность формирует перекос выборки, и при геномном анализе (основанном только на полногеномных данных) доля устойчивых штаммов оказывается завышенной, а генетическая структура общей популяции возбудителя — недостаточно репрезентативной.

И сами авторы не утверждают, что открыли какую-то новую резистентную кладу в Белоруссии?

Конечно, нет. (На самом деле этого не утверждали даже авторитетные СМИ, написавшие о статье, а сообщения о «новых штаммах» появились только в перепостах.) Авторы пишут и правильно цитируют в том числе и наши популяционные работы, и работы авторов из Белоруссии по сполиготипированию и секвенированию, которые уже давно указали на сполиготпип SIT266 и отдельную ветвь внутри Линии 4 как ключевые факторы резистентного туберкулеза в Белоруссии.

Также верно пишут, что выявлены «трансграничные геномные показатели родства между изолятами линии EurA1.1, собранными за пределами Белоруссии, и изолятами из других евразийских стран, таких как Германия, Украина, Молдова, Россия и Грузия».

Собственно, корректное в целом цитирование подтверждает, что это открытие не новость и согласуется с результатами предыдущих популяционных исследований — по крайней мере, на территории бывшего СССР.

Если полногеномное секвенирование до сих пор часто ведется не для тотальной популяционной выборки, то классическое более простое и дешевое генотипирование (например, сполиготипирование) дает более точную оценку распространения того или иного генотипа и показывает, что вне Белоруссии эти штаммы единичны.

В нашей работе 2023 года о вирулентности и филогеографии штаммов LAM (подробнее на PCR.NEWS) есть и про SIT266, и про сполиготипы, родственные ему. В ней собраны данные динамики распространения за последние 20 лет и как хорошо видно на карте, SIT266, показанный красным цветом, был и остается редким вне Белоруссии.

 География распространения сполиготипов LAM в старых и недавних исследованиях. Сполиготипы SIT266 и его предковый SIT264 показаны красным и оранжевым цветом | DOI: 10.1128/spectrum.01392-23    

Если говорить подробнее, еще в первых работах конца 1990-х годов штаммы сполиготипа SIT266 и близкие к нему варианты были выявлены методом сполиготипирования в ряде областей Европейской части России. В более поздних популяционных исследованиях тех же регионов штаммы SIT266 были очень редкими находками — один на 500 штаммов Московского региона, 3 из 800 штаммов СЗФО. И напротив, уже в первом исследовании белорусских штаммов SIT266 составлял 28,4% выборки, уступая только генотипу Beijing (43,8%). Тогда же было высказано предположение, что SIT266 может быть эндемичным для Белоруссии.

Почему такая разница между двумя соседними странами?

Фактор массовости миграции может быть решающим, и хотя имеют место обычные контакты и туризм, массового переселения из Белоруссии в Россию никогда не было. Это может объяснять почему этого штамма в России как почти не было, так и почти нет. Например, в нашей работе по Карелии этот сполиготип был выявлен в одном штамме из 150. Тогда мы предположили, откуда он мог появиться: доля белорусов в Карелии выросла с 0,9% в 1939 году до 10,9% в 1959 году. Хотя в 1960-х годах многие белорусы вернулись на родину, вполне возможно, что штамм «белорусского» генотипа SIT266 представляет собой наследие того времени.

Нужно подчеркнуть то, чего ирландские авторы не отметили, а именно — особенности патогенетических свойств, описанных в мышиной модели. В целом МЛУ штамм SIT266 был достаточно вирулентным, но малолетальным. Однако при правильном и непрерывном лечении мыши не умирали, и новые мутации устойчивости не возникали (подробнее в материале «О мышах, людях и резистентных палочках Коха»).

Кривые смертности леченых (красная линия) и нелеченых (синяя линия) мышей, зараженных различными штаммами M. tuberculosis. Штамм 4542 относится к сполиготипу SIT266: в результате лечения все мыши выжили (в отличие, например, от леченых, зараженных штаммом 396). | DOI: 10.3967/bes2024.084)

Можно предположить, что в Белоруссии SIT266 широко распространился в 1990-е годы, когда были сложности с реализацией программ лечения и контроля ТБ. Но хотя он и пре-ШЛУ, в то же время он малолетальный и не такой вирулентный. Его очень незначительное распространение в новых странах, наблюдаемое сейчас, может быть связано именно с наличием очень большого количества мутаций устойчивости, которые снижают общую жизнеспособность (fitness).

Итак, EurA1.1 — это не новый вариант возбудителя туберкулеза, а новое название варианта сублинии, принадлежавшего к линии 4.3.3/LAM и ранее описанного лекарственно‑устойчивого сполиготипа SIT266.

В заключение отметим, что в статье ирландских исследователей почти ничего не говорится о сполиготипе SIT264, а это важный вопрос. SIT264 является предковым по отношению к SIT266, структура их локусов CRISPR почти одинаковая, тем не менее они различаются методами классического экспериментального сполиготипирования (поэтому и разные номера сполиготипов). Однако они не различаются при биоинформатическом (in silico) сполиготипировании полногеномных данных, как и при сполиго-биочип-типировании — все эти штаммы определяются как SIT264. В то же время SIT264 и SIT266 радикально различаются по распространенности (см. карту выше) и вирулентности. SIT264 — редкий, лекарственно-чувствительный, но более вирулентный и летальный, чем SIT266, при этом в последних исследованиях он стал выявляться немного чаще чем 15–20 лет назад. На него стоит обратить внимание как на потенциально опасный штамм. Для различения SIT264 и SIT266 нужно использовать классический метод сполиготипирования (а не анализ in silico или биочипы). Было бы полезно разработать и ПЦР-подходы к их детекции на основании выявления генотип-специфических маркеров или хотя бы оптимизировать биоинформатический анализ. Что касается биочип-сполиготипирования то, как говорит один из его разработчиков Данила Зименков, в биочип можно бы добавить дополнительную пару праймеров для выявления специфической для SIT266 вставки IS6110.