День ДНК в Пущино

О молекулярной биологии, секвенировании и сборке генома, ASCII-графике ДНК, программе «ДНК-идентификация» Союзного государства и о том, когда появятся российские одномолекулярные секвенаторы.

Credit:
Keith Acari

Двадцать пятого апреля 1953 года в Nature вышли три статьи, посвящннные открытию молекулярной структуры ДНК. К очередной годовщине этого события приурочена конференция «День ДНК — 2022», организованная Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино).

В конференции участвовали не только исследователи, но и представители компаний, предлагающих услуги по секвенированию, занимающихся разработкой и производством секвенаторов. Обсуждались проблемы молекулярной биологии, физические свойства ДНК и, конечно, технологии, достижения и перспективы исследования геномов.

Доклад Ольги Озолинь (Институт биофизики клетки РАН) назывался «О чем можно спросить ДНК». Помимо широкоизвестных задач, связанных с анализом геномов — от филогении вирусов до истории человечества — остаются классические проблемы молекулярной биологии, такие как посттранскрипционное редактирование мРНК.

Известно около 15 примеров таких событий. Один из них — редактирование аполипопротеина В, основного белка липопротеинов низкой плотности, который секретируется клетками и формирует частицы с ЛПНП. На его С-конце есть домен связывания с клетками печени, благодаря ему эти опасные частицы направляются в печень на утилизацию. В гене этого белка есть кодон глутамата, редактируемый в мРНК, причем не во всех, а в тех, которые синтезируются в клетках эпителия кишечника. Замена цитозина на уридин создает стоп-кодон, в результате считывается короткий белок без домена связывания с клетками печени. Повышенное содержание частиц ЛПНП в крови ассоциировано с сердечно-сосудистыми заболеваниями, но именно таким образом холестерин доставляется в другие клетки, которым он необходим. Это редактирование управляется на уровне ДНК: существует консервативная последовательность, регулирующая этот процесс: ДНК «знает» о редактировании ее текста в мРНК-копии.

Интересно организовано редактирование у жгутиковых трипаносомид, вызывающих лейшманиоз. Их митохондриальная ДНК — это макси-кольца, похожие на человеческий митохондриальный геном, и тысячи мини-колец, с которых идет синтез редактирующих РНК. Редактирование уридинов в макси-кольцах регулируется гидРНК с мини-колец и имеет очень сложную природу.

Докладчица и ее коллеги исследуют короткие секретируемые РНК бактерий. Давно известна роль фрагментов тРНК как сигнальных молекул, особенно между бактериями и эукариотами. Оказывается, фрагменты тРНК и других РНК используются также для межклеточной коммуникации в бактериальных сообществах, например, регулируя их рост, и важную роль в этом играет процессинг РНК.

Александр Осипов (ИТЭБ РАН) представил слушателям ДНК не как текст, а как молекулу с определенными физическими свойствами — прежде всего электростатическими. Эти свойства обусловлены нуклеотидной последовательностью, хотя и не вполне однозначно (чем больше GC, тем выше электростатический потенциал, но можно построить такие последовательности, у которых при одинаковом составе он будет отличаться; электростатическую картину могут изменить точечные замены).

Электростатические свойства находятся вне Центральной Догмы. Однако они крайне важны для взаимодействия с белком. В промоторных областях неравномерность электростатического потенциала больше. Японские ученые продемонстрировали, что это имеет значение для взаимодействия белков с ДНК: закрепили на подложке геном фага лямбда, добавили меченую ДНК-полимеразу, картировали частоту посадки вдоль выделенного участка генома и убедились, что она коррелирует с электростатическим потенциалом. Неравномерности электростатического потенциала есть и в местах посадки транскрипционных факторов и других белков.

Сильные промоторы имеют выраженный электростатический элемент в up-положении; там может быть не выражен консенсус, но электростатическая яма присутствует. Не исключено, что это механизм регуляции: у фага Т4 в ранних генах такой элемент есть, в поздних нет.

Взаимодействующие с ДНК белки, в свою очередь, заряжены положительно в области связывания ДНК. Такой белок в электростатическом поле ведет себя как «поплавок»: всегда обращается положительным участком поверхности к молекуле ДНК.

Еще один интересный факт: у внутриклеточного паразита Mycobacterium leprae необходимость в регуляции уменьшена, сглажена у нее и неоднородность электростатического потенциала вдоль ДНК

Рассказ о ДНК-белковом взаимодействии продолжил Анатолий Сорокин (ИБК РАН). Существует так называемый парадокс поиска специфических сайтов связывания белков: у этих сайтов низкая концентрация, их единицы на миллионы нуклеотидов, при этом наблюдаемая скорость поиска на 2-4 порядка больше диффузионной. Как это возможно?

Буквы ДНК читаются другими нуклеиновыми кислотами, но не белками, отметил докладчик. Белки читают физические характеристики, они воспринимают ДНК как ASCII-графику: видят картинку, но значение символов для них несущественно.


Поэтому возможна ДНК-мимикрия: например, белок Ocr бактериофага Т6, ингибитор рестриктазы типа 1, имитирует ДНК. По той же причине геометрические свойства ДНК лучше, чем текст, предсказывают регуляторные последовательности.

Для транскрипционного фактора фактически вся ДНК состоит из слабых сайтов посадки. Как же организован процесс поиска специфического сайта? Еще в 2004 году Михаил Слуцкий и Леонид Мирный из MIT предложили механизм search-and-fold, который рассматривает поиск как одномерную диффузию белка вдоль ДНК: Если есть сайты с большой энергией взаимодействия, скорость диффузии снижается, если «рельеф» гладкий — белок скользит быстро. Позднее появилась концепция двухстадийного поиска, которую можно сравнить с пролистыванием книги и более внимательным чтением нужного отрывка: белок задерживается, когда появляются более глубокие энергетические «ямы». Это разрешает «парадокс поиска».

Еще один интересный пример ДНК-белковых взаимодействий, уже не в природе, — использование ДНК-оригами как каркаса молекулярных машин. Такой каркас может повысить на порядок эффективность сенсора для глюкозы на основе глюкозооксидазы и пероксидазы хрена, если привязать к нему молекулы обоих ферментов, чтобы продукт одной реакции сразу становился субстратом для другой.

Доклад Николая Сироты (ИТЭБ РАН) был посвящен ДНК-кометам. Comet assay (гель-электрофорез индивидуальных клеток, single-cell gel electrophoresis, или SCGE) — доступный и эффективный метод оценки повреждений ДНК, а тем самым и различий индивидуальных клеток в пространственной организации генома, чувствительности к радиационному фактору. Фактически это электрофорез нуклеоидов: клетки в легкоплавкой агарозе, иммобилизованные на предметном стекле, сначала лизируются, потом проводится щелочная денатурация ДНК, и по форме хвоста судят о степени повреждения. Дополнительную информацию дает микроскопическое исследование клеток перед электрофорезом. Прежде чем оценивать повреждающее действие, нужно оценить однородность клеточной популяции, подчеркнул докладчик: неучтенный фактор, например, та же упаковка генома, может повлиять на результаты.

Андрей Улитин (Институт биологического приборостроения РАН, «Биокад», «Нанолек») рассказывал о белках — терапевтических антителах, однако без секвенирования их создание было бы невозможным. Иммуноонкология — лидирующее направление современной онкотерапии, которое, в отличие от химиотерапии и лучевой терапии, активирует собственный иммунный ответ организма. Бестселлеры современного фармрынка — препараты на основе моноклональных антител: Хумира, Китруда, Стелара, Эйлеа, Опдиво.

Технология конструирования антител позволяет использовать «принцип Лего»: вычленять фрагмент, отвечающий за связывание антигена, и присоединять к нему радионуклидные конъюгаты, токсины, иммуноцитокины. CAR-T-терапия (использующая Т-клетки с химерными рецепторами антигена), по сути, тоже основана на принципе Лего.

Докладчик перечислил важнейшие механизмы уничтожения раковых клеток с помощью антител: антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) и Т-клеточно-зависимая клеточная цитотоксичность (TDCC). Разработчики улучшают терапевтические свойства природных антител. Так, замены в сайтах связывания рецепторов, отвечающих за эффекторные функции, могут сильно поднять ADCC активность.

Эффективность терапии антителами могут снижать иммуносупресорные клетки, поэтому нужно разрабатывать лекарства, выключающие это звено, подчеркнул докладчик. Сейчас наблюдается взрывной рост клинических исследований комбинированной терапии.

Секвенирование опухолевых клеток помогает понять, каким образом они ускользают от иммунитета. Сейчас применяется как полногеномное, так и полноэкзомное и таргетное секвенирование. Также секвенирование необходимо для разработки терапевтических антител. Для получения широкого разнообразия антител используют фаговый дисплей («В одном миллилитре – иммунитет многих людей»), гуманизированных мышей с человеческими антителами, гибридомы, а также прямое получение антител от человека.

В «Биокаде» была создана библиотека на фаговом дисплее, содержащая 100 млрд клонов, — «молекулярный грааль, из которого мы черпаем антитела на любой подход», сказал Андрей Улитин. Совмещение фагового дисплея и секвенирования делает возможной быструю эволюцию моноклональных антител. Напомним, что в «Биокаде» создано несколько терапевтических антител, в том числе конкурент Китруды — ингибитор PD1 и ингибитор интерлейкина 6, который купирует цитокиновый шторм при COVID-19.

Темой доклада Марии Логачевой (Сколтех) были проблемы при сборке растительных геномов. Размеры геномов наземных растений варьируют от 60 млн до 150 млрд нуклеотидов — в 50 раз больше, чем у человека. Это разнообразие создается полиплоидией и мобильными элементами: то и другое у растений встречается чаще, чем у животных. В основе всех крупных эволюционных событий у них лежит или аллополиплоидия (кратное увеличение числа хромосом при гибридизации), или автополиплоидия (кратное увеличение числа собственных хромосом). Также высока доля мобильных элементов. Поэтому повторяющиеся последовательности в геноме растения могут составлять до 95% генома, из-за чего возникают альтернативные пути сборки, из которых трудно выбрать правильный.

Еще одна проблема — гетерозиготность. Геномы неродственных людей отличаются на 1-2 нуклеотида из тысячи, таков же уровень отличия между материнским и отцовским гаплотипом, и сборка представляет собой обобщенный гаплотип. У растений отличия достигают нескольких процентов, это создает проблемы.

Наконец, качество данных: известный высокий процент ошибок у многих технологий, например нанопорового секвенирования, а также контаминация, от которой особенно трудно избавиться, если ее создают геномы эндофитов или симбионтов.

Золотым стандартом докладчица назвала сочетание секвирования Pacific Bioscience (длинные прочтения) и консенсусного кольцевого секвенирования. Поскольку PacBio не делает систематических ошибок, достигается довольно высокая точность.

Затем Мария Логачева рассказала про скаффолдинг (выстраивание более длинных участков) с помощью технологии Hi-C, которую обычно применяют для анализа трехмерной структуры хромосом: она позволяет оценить, какие участки генома физически взаимодействуют друг с другом, и помогает выстраивать длинные непрерывные последовательности.

С помощью этих методов докладчица с коллегами собрали геном борщевика Сосновского (1,5 млрд нуклеотидов), затем получили и охарактеризовали гены биосинтеза фотосенсибилизирующего вещества псоралена. Также они собрали геном гречихи: он был особенно богат повторами, которые создали недавние транспозоны (что подтвердил Илья Киров) и отличался высокой гетерозиготностью из-за перекрестного опыления. Еще один интересный объект — пастушья сумка Capsella bursa-pastoris: аллотетраплоид, продукт гибридизации между двумя видами рода, которая произошла 100-300 тысяч лет назад. Интересно, что у предковых видов очень узкие ареалы, а вот гибрид космополитичен. В дальнейшем авторы планируют изучать экологическую пластичность этого вида.   

 Пастушья сумка — гибрид-космополит | 123rf.com

Доклады представителей компании — резидента Сколково «СоцМедика» были посвящены Объединенной базе медицинских знаний (UMKB). Базу создает с 2007 года команда ИТ-специалистов и врачей, сообщил Геворг Бледжянц. Это графовая нейронная сеть, представляющая знания в области медицины и смежных наук.

Про системы интерпретации генома с помощью UMKB рассказала Раушания Гайнуллина. Она отметила, что сегодня интерпретация основывается главным образом на международных базах, содержащих генетические данные, которые могут отличаться от российских.К тому же возможно ограничение использования этих ресурсов из-за геополитической ситуации. Поэтому необходима разработка собственный базы знаний. После того, как пациент сдает свой биоматериал, проводится анализ генома, сравнение с референсным, составляется карта вариаций, выполняется интерпретация и создается генетическая карта для врача. 

«Главное, что весь массив информации поступает в автоматическую систему поддержки принятия врачебных решений», — отметил Александр Осипов. Он рассказал о том, как UMKB может применяться в фундаментальных исследованиях. Полезным будет анализ биомедицинских текстов и построение на их основе формализованной базы знаний. Главная изюминка — модуль анализа текстов на естественном языке, что и делает возможной формализацию: представление в виде связей между сущностями. База будет автоматически пополняться массивами данных из научной литературы, клинических рекомендаций, инструкций к препаратам — потенциально весь накопленный опыт в области медицины. Для исследователей это огромное облегчение, отметил докладчик: эффективность работы с готовыми связями будет несопоставимо выше, чем у традиционных способов работы с литературой. Кроме того, есть возможность интегрирования и сопоставления всех омиксных данных для человека и для модельных животных, что обеспечит взаимодействие разных областей биологии.

Секция после перерыва была посвящена современным технологиям секвенирования. Григорий Аникин (MGI) представил слушателям технологию DNBSeq, а также другие продукты китайской компании MGI Tech — амплификационную панель ATOPlex и новые наборы MGIEasy для быстрой пробоподготовки.

Аббревиатура DNB означает DNA NanoBall: при получении библиотеки концы фрагмента соединяются, и он амплифицируется с помощью полимеразы фага Ф29 методом катящегося кольца, получается конкатемер из 300-500 копий исходной последовательности, адаптеров и баркодов, и этот наноклубок загружается в ячейку. Такой подход имеет ряд преимуществ по сравнению с ПЦР-амплификацией. Новые наборы MGIEasy сократили время пробоподготовки в два раза, кроме того, увеличено количество баркодов.

Отечественные технологии секвенирования ДНК представил Яков Алексеев, научный директор ООО «Синтол». (См. интервью с Яковом Алексеевым на PCR.NEWS.) Как и на МД-2021, он напомнил о стремительном росте рынка секвенирования, а также смежных технологий. Рынок ПЦР достиг сопоставимых значений во время пандемии. Набирают обороты изотермические экспресс-методы, позволяющие провести амплификацию за полчаса или быстрее.

Яков Алексеев назвал пятерку компаний-лидеров современного рынка секвенирования — Thermo Fisher Scientific, Illumina, Pacific Biosciences, Oxford Nanopore и китайская MGI Tech. В нынешней кризисной ситуации на российском рынке осталась только последняя. Российские продукты отчасти способны конкурировать с зарубежными классическими секвенаторами («Нанофор 05»), но не с полногеномными. Сейчас поставлено более 120 приборов «Нанофор 05», и после ухода Thermo Fisher заказы выросли: «Каждую неделю или день у нас продажи в институты большой академии или мединституты», — сказал докладчик.    

 «Нанофор 05» | Синтол

Ранее прибор работал на реагентике Thermo Fisher, однако теперь остались только китайские наборы, причем производители существенно подняли цены: «По некоторым позициям в два-три раза выше Thermo Fisher; бизнес, ничего личного». Однако теперь «Синтол» представляет первый полностью российский набор для секвенирования по Сенгеру. Качество данных, полученных на «Нанофор 05» на новой реагентике, как сообщил докладчик, сопоставимо с теми, что получаются на американских или китайских наборах; отечественные наборы и пластик позволяют «выйти на экономию в четыре раза минимум».

Следующая разработка «Синтола» — отечественный прибор для массового параллельного секвенирования «ДНК Нанофор СПС». Госиспытания закончены в 2020 году, однако, поскольку результаты разработки принадлежат Минздраву РФ, нужна лицензия, чтобы начать выпуск серии.

Тестовые запуски делали на реагентах MiSeq и на своей химии. Качество, полученное на отечественной реагентике, пока ниже (82% против 97% у MiSeq). Есть проблемы с прочтением обратной цепи. С другой стороны, молекулярные колонии в отечественной версии имеют маленький размер, а значит, с одной и той же площади в перспективе можно получить больше материала.

Яков Алексеев рассказал о разработке одномолекулярного секвенирования ДНК и РНК, поддержанной грантом Минобрнауки. Принцип технологии, разработанной совместно с партнерами из Физтеха и Баумановского университета, — наноколодец, на дне которого находится молекула полимеразы; она читает молекулу нуклеиновой кислоты, используя гексафосфаты, меченные флуоресцентными метками. Высокая точность достигается за счет того, что молекула кольцуется и прочитывается много раз. Полимераза создана на основе Ф29, но не идентична ей. Опытный образец может появиться к концу 2023 года.

В дальнейших планах компании — классический высокопроизводительный капиллярный секвенатор «Нанофор 06» (24 капилляра); новое ПО; серийный выпуск секвенатора «Нанофор СПС», возможно, к началу 2023 года; наборы реагентов и расходные материалы для секвенирования ДНК и РНК, а также производство пластика: стрипов, пробирок, наконечников, флаконов. «Пока альтернатива — только Китай, — сказал Яков Алексеев. — В Китае есть пластик хороший, плохой и очень плохой, сюда приезжает не самый лучший».

Владимир Зубов (ИТЭБ РАН) сделал традиционный обзор рынка секвенирования в текущем году. Безусловным лидером геномных гонок остается Illumina: более 8000 заказчиков, объемы продаж — 4,5 млрд долларов. В начале года объявлено о двух новинках, обе пока остаются загадочными. Новая химия для секвенирования путем синтеза, Chemistry X, по-видимому, предполагает замену метилазидтрифосфатов на какие-то другие блокаторы, а также замену полимеразы. Также заявлено о технологии Infinity, которая позволит получать длинные риды на инструментах «Иллюмины», с более высокой производительностью, чем у конкурентов, и будет использовать меньшие количества ДНК. В раннем доступе она должна появиться во втором полугодии. Флагман продаж — NovaSeq 6000, самая высокопроизводительная платформы NGS-секвенирования от Illumina; продано и установлено порядка 1000 приборов, они могли бы за 1000 лет отсеквенировать все человечество. Также появится клиническая версия NovaSeq Dx, в том числе версия для китайского рынка. Нишу доступного секвенирования небольших геномов занимает маленький iSeq.

Главных проблем у Illumina две, подчеркнул докладчик: окончание действия ключевого патента и с нетерпением ожидающие этого конкуренты, прежде всего MGI.

Из новинок от MGI Владимир Зубов отметил химию CoolMPS — новую технологию секвенирования путем синтеза, в которой нуклеотиды проявляют флуоресцентно меченными антителами. Интересна также технология sequencing by binding компании Omniome. Она хотела выпустить технологию еще в 2021 году, но ее купила PacBio, и теперь технология выйдет на рынок, очевидно, в будущем году.

Новая компания Element Biosciences, СЕО и сооснователь которой Молли Хэ и многие ее коллеги ранее работали в «Иллюмине», объявила о начале продаж секвенатора AVITI. Технология сходна с той, что предложила Omniome, но подробности не раскрываются. При этом компания заявляет о точности на уровне Q40 и стоимости секвенирования как на NovaSeq 6000.

У всех флуоресцентных секвенаторов есть общие проблемы, заметил Владимир Зубов: дорогостоящие реагенты и конкуренты. Oxford Nanopore выпускает PromethION P2 — возможная альтернатива NextSeq от Illumina. Нанопор дешевеет, цену за геном человека выставляет около $1000, а точность секвенирования удалось повысить до 99,3—99,5%. Растут инвестиции, Oxford Nanopore продает свои акции и вступила в 2022 год, имея в кармане более 4 млрд долларов. Однако у них нет патентной защиты.    

 MinION с проточной ячейкой |  ONT

Нанопоровый секвенатор, добавил докладчик в заключение, планирует вывести на рынок компания Axbio — американский стартап, один из сооснователей которого — выходец из России выпускник СПбГУ Игорь Иванов.

Точность первичных ридов нанопорового секвенирования достигла Q20, дуплекс-секвенирования — Q30, после бейс-коллинга даже выше, отметил Артем Ермаков (ИТЭБ РАН). Появился режим коротких ридов, от 20 нуклеотидов. Развитие бейсколлеров делает возможным точное выявление модифицированных нуклеотидов. Докладчик рассказал о валидации российских реагентов для пробоподготовки (например, выделение ДНК на магнитных частицах – «Силекс», обратная транскрипция и амплификация — набор «Mint» от Евроген, аналогичный нанопоровским). Анализировали, в частности, транскриптом клеток после воздействия бактериальных липополисахаридов (транскрипция 17585 генов в образце). Докладчик с коллегами оптимизировали процесс, чтобы сэкономить ферменты и баркоды, снизить стоимость секвенирования. Они планируют дизайн собственных баркодов и подбор отечественных ферментов для подготовки библиотек, на этапах лигирования баркодов и адапторов. По мнению Артема Ермакова, сейчас уже возможно говорить о создании отечественного нанопорового секвенатора.

Директор компании «Айвок» Сергей Долгушин так и назвал свой доклад: «Нанопоровый секвенатор необходим российской науке. Пора делать нанопору!» У компании есть наработки по созданию портативных приборов, таких как термоциклер Termix или изотермический реал-тайм ДНК-амплификатор Lampix. «В технологии прецизионного термостабилизирования мы эксперты», — заявил Долгушин. Почему бы не сделать маленький секвенатор в виде коробочки с одноразовой ячейкой, который умещается на ладони, как MinION? «Айвок» и его партнеры «Иннова плюс» и «КвинтТех» (Зеленоград) проанализировали технологии, которые для этого нужны. Для электроники, аппаратного, передачи данных практически все есть; вкладываться нужно в реагенты и ПО.

Докладчик отметил важность регуляторики, а также подготовки забора проб, чтобы сделать его массовым и стандартизированном. Важно также ПО, в том числе и специальное, под задачи прогнозирования и диагностики, инженерной биологии. Предполагаемые области использования такого мини-секвенатора — наука, сельское хозяйство, ветеринария, фармацевтика, медицина, онкология, микробиомика.

Сергей Долгушин отметил риски, связанные с ограничением поставок электроники (так, скоростные аналого-цифровые преобразователи в РФ сейчас вообще не поставляются) и реагентов. Риски, связанные с ПО, напротив, представляются низкими. Получить через пять лет опытный образец реально, но необходимо понимание, как на этом проекте можно заработать.

В перерыве Сергей Долгушин вынул из кармана изотермический реал-тайм амплификатор Lampix V — чуть больше губной помады в коробочке. Прибор регистрирует флуоресценцию по одному каналу (SYBR/FAM), держит температуру 65±° С.

— Крышка в этой версии не подогреваемая, но сюда легко добавить такую же подогреваемую крышку, как в большом LAMPIX8, на 8 пробирок, — объясняет Сергей Долгушин. — Он передает данные по блютусу в телефон. Мы позиционировали его для школьников, например, для олимпиад по биологии.

Миниатюрный прибор мог бы найти применение, например, в ветеринарии, агрономии, но необходимы доступные реагенты для LAMP и решение регуляторных вопросов.

Дмитрий Квон, руководитель ЦКП «Опорный центр секвенирования» Курчатовского института, начал свое выступление с провокационного вопроса: произошло ли что-то новое в NGS за последние десять лет. По большому счету, технологии достигли предельного уровня, и когда закончится патентная защита, выживут самые средние. Какие задачи сейчас стоят перед секвенированием? Когда изучен геном человека, можно двинуться вглубь, изучая соматические варианты, транскриптомику, эпигенетику, либо вширь — проводить популяционные исследования и получать больше геномов. Последнее особенно важно для России, население которой генетически гетерогенно и при этом недогенотипировано. По мнению Дмитрия Квона, NGS с низким покрытием вполне может заменить микрочипы и окажется даже дешевле. Для движения «вглубь», однако, необходимо повышение точности секвенирования, для «вширь» – дальнейшее снижение цены. Другие направления будущего — мультиомные и системные подходы, методы метагеномных исследований.

Доклад Владимира Орехова (компания Gordiz) был посвящен истории анализа ДНК в судебной генетике. До 1985 года для этого применялись белковые маркеры (в РФ они применяются до сих пор). Но их возможности ограничены, особенно при анализе смешанных образцов. В 1985 году Алек Джеффрис предложил исследовать гипервариабельные минисателлиты. Дискриминирующий потенциал метода достигал 106, радиоактивная метка обеспечивала высокую чувствительность, дифференциальный лизис позволял удалять из образца мужской или женский генетический материал, однако с деградированными образцами технология работала плохо. В качестве примера Владимир Орехов рассказал историю идентификации «убийцы из Нарборо» Колина Питчфорка, в которой ключевую роль сыграл метод Алека Джеффриса. Это было первое оправдание невиновного благодаря ДНК-анализу и первый массовый скрининг в рамках следственных действий.

Из-за трудоемкости изначального метода Джеффриса многие отказались от мультилокусной пробы в пользу однолокусной, по уникальному высокополиморфному локусу, но дискриминирующий потенциал метода стал меньше, и это не решало проблему с деградацией материала. В 1991 году появилось генотипирование локусов STR (коротких тандемных повторов) с помощью ПЦР. Оно подходило для работы со старыми образцами, но при генотипировании для национальной базы данных проблему создавали статтеры (заиканий полимеразы на повторах). Были выбраны локусы, максимально свободные от этого недостатка (тетрануклеотидные повторы).

Капиллярный электрофорез сделал возможной автоматизацию метода; в 1992 году появился первый коммерческий прибор от Beckman, в 1993-м продемонстировали типирование минисателлитных маркеров. Еще один важным моментом стало развитие флуоресцентных меток, в чем преуспела Applied Biosystems с генетическими анализаторами ABI 310, ABI 3100; Thermo Fisher 3500 не так уж сильно от них отличается.

Важной вехой стал 1993 год: началось использование гена амелогенина как маркера пола, Павел Иванов и Питер Гилл с коллегами выполнили первую работу по идентификации останков Романовых. Также была выполнена первая идентификация в месте массовой гибели людей (трагедия в Уэйко).

В 1995 году в Великобритании появилась первая криминалистическая база данных, первоначально по 6 STR-маркерам, в 1999 году их количество увеличили до 10, в 2012-м — до 16. В Российской Федерации первая такая база данных появляется в 2011 году, и в 2017-м она расширена до 21 маркера.

В последние 10 лет принципиального развития технологии анализа ДНК в криминалистике не происходит, сказал в заключение докладчик. Но решаются сложные задачи: анализ смесей, низкокопийные образцы, контроль контаминации и переноса материала на улики, методология сбора образцов («Выделить ДНК и типировать несложно. Сложнее найти ДНК-след и доказать, что он появился именно вследствие преступления»).

Научный руководитель ИОГен РАН, академик Николай Янковский рассказал о научной программе Союзного государства «ДНК-идентификация». Проект был начат после того, как в 2011 году Елена и Олег Балановские помогли установить личность смертника, устроившего теракт в аэропорту Домодедово. Другим громким делом была идентификация новосибирского насильника: Владимир Степанов из томского Института медицинской генетики определил район в западной Бурятии, откуда происходили предки преступника. В 2017 году стартовала программа, полное название которой — «Разработка инновационных геногеографических и геномных технологий идентификации личности и индивидуальных особенностей человека на основе изучения генофондов регионов Союзного государства». Как отметил Николай Янковский, средняя цена раскрытия одного преступления — более 1 млн рублей, и генотипирование может снизить эту сумму.

До 2017 года у исследователей имелись данные о 48 группах населения (900 образцов). Теперь исследованы более 140 групп (34850 образцов). Образцы — буккальный эпителий, слюну, волосы, кровь — отбирают от неродственных индивидов, проживающих на исторически сложившейся территории обитания того или иного народа. Однако необходима в пять раз большая плотность данных; в идеале это позволит сузить круг подозреваемых до близкого родства или территории происхождения. (Типирование по Y-хромосоме показывает, что в некоторых деревнях большинство мужчин — потомки одного мужчины, иногда Y-хромосомный гаплотип достоверно указывает на фамилию.) Сейчас уже более 70 экспертиз успешно проведены по заказу управлений Следственного комитета и МВД.

Поможет ли исследование малых народов и населения деревень раскрывать преступления, которые совершаются в городах-миллионниках? Да, поскольку все крупные города растут за счет приезжих, а не за счет рождаемости. Доля коренных русских в Москве не превышает 5%. При этом частоты различных гаплотипов в Москве, Санкт-Петербурге, Новосибирске отличаются друг от друга и от базы «русских». Наибольшие отличия — по маркерам игрек-хромосомы. За 10 поколений произойдет почти полная смена генофонда столицы, сказал докладчик.    

123rf.com

Кто приезжает в города? В Москву — главным образом уроженцы ЦФО, но сейчас радиус брачной миграции вырос до 1725 км. Поколение за поколением растет доля Y-хромосом, типичных для южных стран, и потомки приезжих в основном называют себя русскими. При этом у русских женщин предпочтения по национальности не отмечено.

Этнические группы в больших городах распределены неравномерно (так, в Минске 60% цыган живут в двух районах города). Люди одной национальности селятся компактно, чтобы оказывать друг другу поддержку, но это приводит к стратификации и межэтническим конфликтам, что тоже важно для криминалистов.

Николай Янковский рассказал о разработке набора реагентов, который позволяет работать с рекордно низким количеством ДНК, в том числе деградированной до десятков нуклеотидов. В качестве примера он привел исследование Евгения Рогаева с коллегами по идентификации волос из портрета царевича Алексея.

Докладчик напомнил о важности более широкого изучения геномного разнообразия россиян (не только по STR-маркерам). Например, нидерландские наборы для определения цвета глаз по SNP не выявляют темноглазых жителей Сибири, потому что соответствующие варианты отсутствовали в базах данных. «Китайцы хотели к 2030 году секвенировать все свое миллиардное население, — заметил Николай Янковский. — Но у нас такой программы нет».

Другие интересные направления программы — анализ метаболитов в образце, оценка возраста (здесь удалось добиться довольно высокой точности — плюс-минус пять лет при достаточном количестве ДНК). В дальнейшем возможно исследование эпигенетических маркеров стиля жизни, например, употребления наркотиков.

Добавить в избранное

Вам будет интересно