Итоги 2020 года

COVID-19

Все-таки начнем с пандемии COVID-19 и ее последствий для науки и медицины. В США первой пандемией эпохи молекулярной диагностики считается «свиной грипп» 2009 года. Однако первая пандемия, во время которой ПЦР-тесты массово делались не только в Европе, Америке и Австралии, но и в Африке, идет сейчас. Экстремальная ситуация заставила все страны многократно увеличить объемы тестирования, так что после победы над COVID-19 диагностика многих других заболеваний сможет выйти на новый уровень.

Диагностика COVID-19: CRISPR

На рынок вышло множество тест-систем для выявления коронавируса SARS-CoV-2, в том числе инновационных. Всерьез заявили о себе CRISPR Dx — диагностические приложения CRISPR-Cas. Их разработали компании Mammoth Biosciences (один из соучредителей — нобелевский лауреат 2020 года Дженнифер Дудна) и Sherlock Biosciences (среди соучредителей пионер CRISPR Фэн Чжан). Обе компании уже три года работают над платформами тестирования, в которых система CRISPR-Cas распознает определенную последовательность не для редактирования, а для генерации сигнала. В мае 2020 года впервые получил разрешение на применение в экстренной ситуации в США инструмент CRISPR-Dx: набор Sherlock CRISPR SARS-CoV-2. Тест DETECTR CRISPR-Cas12 от Mammoth Biosciences был разрешен в сентябре. Обе компании продолжают работать над новыми вариантами тест-систем.

Диагностика COVID-19: нанопоровое секвенирование

Приборы британской компании Oxford Nanopore Technology всего несколько лет назад считалась экзотикой. А в этом году тест LamPORE COVID-19 начал применяться в Великобритании, получил маркировку CE, на очереди другие страны. Перед анализом проводится изотермическая амплификация, к амплифицируемым участкам присоединяются нуклеотидные штрихкоды, уникальные для каждого образца. Затем образцы смешивают и проводят секвенирование на приборах ONT. MinION может проанализировать до 96 образцов за час, 1152 образца — за четыре с половиной часа. GridION — в пять раз больше.

Диагностика COVID-19: тест на антиген коронавируса от Abbott

В конце августа получил разрешение FDA иммунохроматографический тест BinaxNow COVID-19 Ag Card компании Abbott. Тест размером с кредитную карточку предназначен для определения нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 в назальном мазке немедленно после взятия. Стоимость одного теста — $5, время до получения результата — 15 минут. Тест высокоспецифичен, но в чувствительности уступает ПЦР. Тестировать рекомендуется пациентов с активной инфекцией в течение семи дней после первых симптомов. Результат появляется в мобильном приложении смартфона. В декабре FDA разрешило пациентам, у которых врач подозревает COVID-19, использовать этот тест самостоятельно в домашних условиях.

Вакцины на основе мРНК

Новый класс вакцин: в организм доставляется матричная РНК вирусного белка в липидных частицах. РНК-вакцины можно производить полностью in vitro, для этого не нужны даже культуры клеток. К сожалению, поставлять их необходимо в замороженном виде, лиофилизировать нельзя, что затрудняет хранение и транспортировку.

К концу года регистрацию прошли две мРНК-вакцины. Одну разработала компания Moderna совместно с Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний США. Другую — небольшая немецкая компания BioNTech и фармгигант Pfizer при участии китайской Fosun Pharma. Moderna начала разработку еще в январе, первые партии были готовы к клиническим испытаниям в конце февраля.

Вакцина BNT162b2 от BioNTech и Pfizer зарегистрирована 2 декабря в Великобритании, позднее в декабре она получила разрешение в ряде других стран, включая США. Вакцина компании Moderna mRNA-1273 одобрена в США 18 декабря; она разрешена также в Канаде.

Геномы коронавируса

Глобальная научная инициатива GISAID основана в 2008 году. Ее задача — обеспечивать открытый доступ к геномам вирусов гриппа, а теперь и коронавируса. Масштаб секвенирования вирусных геномов был беспрецедентным, как и многое в эту пандемию: на конец декабря выложено более 292 тысяч геномов коронавируса. Результаты визуализированы на сайте nextstrain.org (последовательности представлены выборочно). Есть на GISAID и российские геномы.

Нобелевские премии

Технология CRISPR-Cas — молекулярный инструмент года. Нобелевская премия по химии присуждена Дженнифер Дудне (Калифорнийский университет в Беркли, США) и Эмманюэль Шарпантье (Институт науки о патогенах Общества Макса Планка, Германия) «за разработку метода геномного редактирования» — систему CRISPR-Cas9. В ее основе лежит механизм, обеспечивающий бактериям защиту от вирусов. CRISPR-Cas9 с высокой точностью вносит двухцепочечные разрывы в ДНК. CRISPR-системы с Cas9 и с другими CRISPR-нуклеазами нашли применение в исследованиях, диагностике и медицине.

Лауреатами Нобелевской премии по физиологии или медицине в 2020 году стали Харви Альтер (Национальные институты здравоохранения, США), Чарльз Райс (Рокфеллеровский университет, США) и Майкл Хоутон (Университет Альберты, Канада) за открытие вируса гепатита C. В 1970-х в лаборатории Альтера описали гепатит «ни A, ни B» — вирусное заболевание, которое может передаваться реципиенту с кровью зараженного донора. В 1980-х Хоутону с коллегами удалось получить сиквенс генома вируса. Патоген был отнесен к флавивирусам и получил название «вирус гепатита C». Райс доказал, что именно этот вирус вызывает гепатит «ни A, ни B». В настоящее время доступна высокочувствительная диагностика инфекции, а прием противовирусных препаратов позволяет излечить гепатит C в более чем 95% случаев.

CRISPR-редактирование приводит к потере хромосом

Несколько омрачает триумф CRISPR-Cas статья, опубликованная в октябре в Cell. Группа ученых из США использовала CRISPR-Cas9 для редактирования гена EYS, ассоциированного с пигментным ретинитом, в сперматозоидах мужчин — носителей патогенного варианта. Анализ клеток эмбрионов, полученных при оплодотворении донорских яйцеклеток отредактированными сперматозоидами, показал, что успешная репарация разрывов в отцовской хромосоме происходит примерно в 50% случаев. В остальных случаях регистрировались частичная или полная потеря отцовской хромосомы или нецелевые разрывы. Это и другие исследования подтверждают, что технология CRISPR-Cas9 недостаточно совершенна для терапевтической коррекции мутаций в эмбрионах.

CRISPR-терапия наследственных заболеваний крови проходит испытания

Но можно редактировать соматические клетки. В августе 2019 года компании Vertex Pharmaceuticals и CRISPR Therapeutics (в числе основателей последней Эммануэль Шарпантье) начали экспериментальное лечение серповидноклеточной анемии (СКА). У пациентки, 34-летней Виктории Грей, взяли стволовые клетки крови, исправили их геномы с помощью CRISPR и вернули в организм. CRISPR Therapeutics в том же году сообщила об успехе в лечении другой гемоглобинопатии — бета-талассемии. В обоих случаях редактирование повышает уровень фетального гемоглобина в эритроцитах.

В декабре 2020 года опубликованы результаты клинических испытаний, в которых участвовали пациентка с СКА (та самая Виктория Грей) и 19-летняя девушка с бета-талассемией. Через семнадцать месяцев после начала лечения Виктория, мать четырех детей, называет результаты «чудесными». Вторая пациентка получала переливания крови с рождения, теперь обходится без них.

Генной терапией серповидноклеточной анемии занимаются и другие научные группы, например, в Бостонском детском госпитале, для генной терапией бета-талассемии компания Bluebird предлагает препарат Zynteglo. Те и другие используют лентивирусные векторы, а не CRISPR.

Одобрен третий препарат на основе РНК-интерференции

В ноябре FDA одобрило препарат Oxlumo (люмасиран) компании Alnylam как средство против первичной гипероксалурии первого типа (PH1). Действующее вещество люмасирана — малая интерферирующая РНК к мРНК фермента гликолатоксидазы. PH1 — редкое заболевание, при котором происходит избыточная выработка оксалата. Это может привести к угрожающей жизни патологии почек и другим системным осложнениям. Уменьшение концентрации гликолатоксидазы снижает количество глиоксилата — субстрата для продукции оксалата. По итогам испытаний препарат одобрен для всех возрастных групп.

Два других одобренных препарата на основе РНК-интерференции — гивосиран и патисиран — также принадлежат Alnylam.

Решена задача о фолдинге белков

В этом году алгоритм AlphaFold, разработанный стартапом DeepMind, решил проблему с полувековой историей: как эффективно предсказывать третичную структуру белка по его первичной структуре. Каждые два года, начиная с 1994-го, проводится CASP — соревнование по решению этой задачи. Участники получают аминокислотные последовательности ста белков, структуры которых неизвестны. Одни группы определяют структуры экспериментально, другие используют вычислительные алгоритмы. Результат предсказания вычислительными методами оценивается по шкале от 0 до 100. Метод, набравший больше 90 баллов, приравнивается к экспериментальному. В 2020 году AlphaFold набрал 92,4 балла, обойдя остальные команды.

Предыдущий вариант алгоритма AlphaFold выиграл CASP в 2018 году, однако результат был далек от 90 баллов. Оптимизированная версия сочетает глубокое обучение с так называемым алгоритмом внимания, который имитирует действие человека, собирающего пазл.

Криоэлектронная микроскопия достигла атомного разрешения

В октябре вышли две работы о получении самых резких в мире изображений с помощью одночастичной криоэлектронной микроскопии. Впервые стало возможно рассмотреть локализацию отдельных атомов в белке.

В первой работе ученые из Института биофизической химии Макса Планка (Геттинген, Германия) получили изображение апоферритина с разрешением 1,25 Å. Изображение содержит в два раза больше 3D-информации, чем действующий мировой рекорд разрешения (1,54 Å).

В другой статье ученые из Великобритании, Нидерландов и Бельгии рассказали о реконструкции человеческого мембранного белка — гомопентамера рецептора β3 GABA_A — с разрешением 1,7 Å. Применение той же техники к мышиному апоферритину дало изображение с разрешением 1,22 Å. Эта команда, как и авторы первой работы, добились столь высоких результатов за счет оптимизации приборной части.

ВИЧ: «ударь и убей»

В январе были опубликованы две статьи о реактивации латентного ВИЧ. Когда больной получает антиретровирусную терапию (АРВ), репликация вируса приостанавливается, однако сохраняется популяция CD4+ Т лимфоцитов с латентной формой вируса, невидимая для иммунной системы хозяина. Если реактивировать латентные вирусы, зараженные клетки удастся уничтожить (стратегия «ударь и убей»). Первый способ основан на активации клеток AZD5582 — малой молекулой, описанной семь лет назад сотрудниками AstraZeneca как потенциальное средство от рака. Второй способ основан на удалении из кровотока клеток CD8+ Т-лимфоцитов, участвующих в подавлении репликации ВИЧ; затем пациенту вводят препарат N-803, активирующий транскрипцию вируса.

ВИЧ: элитные контроллеры

Организмы некоторых ВИЧ-инфицированных контролируют репликацию вируса без АРВ: их анализы на ВИЧ отрицательны. Таких людей называют «элитными контроллерами». Ученые из MIT, Гарвардского университета и других научных центров изучили тысячи геномов Т-лимфоцитов, взятых от элитных контроллеров и обычных инфицированных. Оказывается, у элитных контроллеров провирусные последовательности встроены в определенные области генома, где им трудно активироваться. Маловероятно, что вирусы, инфицируя некоторых людей, «предпочитают» интегрироваться в эти участки. Скорее провирусные последовательности, более склонные к активации, каким-то образом были устранены на раннем этапе инфекции.

Авторы этого исследования обнаружили еще одного человека, который, возможно, полностью излечился от ВИЧ. В клетках 66-летней Лорин Вилленберг из Калифорнии не нашли провирусов, способных реактивироваться. В отличие от «лондонского» и «берлинского» пациентов, Лорин не пересаживали костный мозг. К сожалению, «берлинский пациент», Тимоти Рэй Браун, умер в этом году от рецидива лейкемии.

Популяционная генетика и древняя ДНК

Эти новости весь год успешно конкурировали с коронавирусными сенсациями. Предки-неандертальцы обнаружены не только у жителей Евразии, но и у африканцев. А предки неандертальцев и денисовцев 700 тысяч лет назад скрещивались с «супердревней» популяцией гоминин. Неандертальцы в какой-то момент утратили свою исконную Y-хромосому, ее заменила Y-хромосома людей современного типа. Денисовские люди жили не только в Денисовой пещере, а широко расселялись по Евразии. И наконец, Сванте Паабо предположил, что генетические варианты на 3-й хромосоме, связанные с более тяжелым протеканием COVID-19, мы получили от неандертальцев.

Аллель гена лактазы, который позволяет взрослым людям употреблять в пищу молоко, распространился в Европе лишь в последние 3000 лет, намного позже, чем скотоводство. У монголов, несмотря на молочную диету, мутация толерантности к лактозе никогда не достигала высокой частоты; возможно, все дело в микробиоте кишечника. Секвенирование 442 древних геномов показало, что далеко не все викинги были скандинавами по происхождению. А в геноме вируса оспы эпохи викингов было больше активных генов, чем у более поздних вариантов вируса. Все собаки произошли от одной древней популяции волков, и в дальнейшем изменения в их геномах указывали на тесную связь с человеком.

Illumina против BGI

В феврале китайская компания MGI, часть холдинга BGI Group, объявила о создании новой системы, которая позволит секвенировать геном человека за $100. Платформа для секвенирования и химия CoolMPS должны были выйти на американский рынок, однако компания Illumina заявила о нарушении патентных прав.

В июне федеральный суд США удовлетворил запрос Illumina и ввел предварительный запрет на распространение и продвижение в США платформ BGI и ее дочерних организаций. BGI подала апелляцию, и в августе запрет был частично приостановлен: окружной суд Северного округа Калифорнии разрешил внутреннее некоммерческое использование секвенаторов китайской фирмы, если не применяются реагенты, нарушающие патенты Illumina. В этом же месяце федеральный суд США обязал Illumina собрать на видеоконференцию не менее девяти изобретателей патентов, касающихся химии для секвенирования: возникли подозрения, что истец склоняет изобретателей отказаться от дачи показаний.

В сентябре BGI получила разрешение на внутреннюю разработку CoolMPS. После этого BGI и Illumina подали запрос на отклонение апелляции BGI, который был удовлетворен в конце месяца.

В США разрешили есть мясо свиней с изменениями в геноме

Управление по контролю продуктов и лекарств США (FDA) одобрило свиней с измененным геномом. У свиней GalSafe от компании Revivicor поврежден ген фермента GGTA1, который производит углевод альфа-гал (галактоза-альфа-1,3-галактоза). Альфа-гал содержится в мембранах клеток большинства млекопитающих, некоторые люди из-за него страдают аллергией на красное мясо и биомедицинские продукты животного происхождения. На данный момент FDA одобрило употребление в пищу мяса GalSafe, заявки на одобрение медицинских продуктов надо будет подавать отдельно.

Свиньи GalSafe — пятое животное с целевыми изменениями в геноме, одобренное FDA. Остальные четыре — быстрорастущий лосось компании AquaBounty, козы, дающие молоко с белком-антикоагулянтом, куры, яйца которых содержат фермент для лечения редкого заболевания, и кролики — производители фактора свертывания крови VII.